该方案详细介绍了评估纳米乳剂麦冬皂苷D佐剂是否能够促进有效细胞免疫反应的方法。
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摘要
摘要
佐剂作为疫苗的主要成分，可直接诱导或增强与抗原相关的强烈、广泛、先天性及适应性免疫反应。麦冬皂苷D（OP-D）是从植物中提取的一种纯化成分 Ophiopogon japonicus，已被发现可作为疫苗佐剂使用。通过采用低能耗乳化法制备纳米乳剂麦冬皂苷D（NOD），可有效克服OP-D溶解度低和毒性高的问题。本文中，一系列 体外 细胞活性评估方案的考察. 采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测L929细胞的细胞毒性作用。随后，通过ELISA和ELISpot方法检测免疫小鼠脾细胞经刺激和培养后分泌的细胞因子水平及相应免疫细胞数量。此外，利用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察来源于C57BL/6小鼠、经GM-CSF联合IL-4孵育成熟后的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）对抗原的摄取能力。重要的是，将空白小鼠的腹腔巨噬细胞（PMs）与佐剂共培养24小时后，通过ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）细胞因子水平，以确认巨噬细胞的活化状态。期望本实验方案可为其他研究人员提供直接且有效的实验手段，用于评估新型疫苗佐剂的细胞免疫应答效果。
引言
疫苗是预防和治疗传染性疾病及非传染性疾病的重要手段。在疫苗配方中适当添加佐剂和递送载体，有助于增强抗原的免疫原性并产生持久的免疫应答1。除经典的佐剂铝盐（铝盐）外，目前已有六种佐剂被用于上市疫苗：MF592,3、AS043、AS033、AS013、CpG10184 和 Matrix-M5。通常情况下，当人体遭遇病毒感染时，第一道和第二道防线（皮肤、黏膜和巨噬细胞）会率先清除病毒，最终激活第三道防线，即免疫器官和免疫细胞。自20世纪20年代初以来，铝及其盐类一直是人类疫苗中应用最广泛的佐剂，可引发有效的先天性免疫应答6。然而，有研究提出，经典佐剂通过激活抗原呈递细胞（APCs），刺激免疫细胞产生特定类型的细胞因子和趋化因子，这是佐剂发挥作用的机制之一，也可能是佐剂对特异性免疫应答仅产生短暂效应的原因之一7。目前获批用于人类的佐剂种类有限，这成为开发能够诱导有效免疫应答疫苗的制约因素8。
目前，越来越多的佐剂研究显示出在小鼠中诱导强烈细胞免疫反应的能力。QS-21作为佐剂已被证明可诱导平衡的辅助性T细胞1（Th1）和辅助性T细胞2（Th2）免疫反应，产生更高水平的抗体滴度，并延长保护作用，但其强烈的毒性和溶血特性限制了其作为独立临床佐剂的开发9,10。OP-D（鲁斯可皂苷元-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃岩藻糖苷）是从中药麦冬（Ophiopogon japonicus）根部分离出的一种甾体皂苷4。此外，它也是麦冬（Radix Ophiopogonis）中主要的药理活性成分（参麦散）之一，已知具有一定的药理特性11。麦冬属于百合科（Liliaceae），广泛用于细胞炎症和心肌损伤的抑制与保护作用。例如，OP-D可改善二硝基氯苯（DNCB）诱导的特应性皮炎样病变以及BALB/c小鼠中肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的炎症性HaCaT细胞12。重要的是，OP-D可促进心血管系统的抗氧化保护作用，并通过减少活性氧（ROS）的生成和抑制线粒体膜损伤，保护心脏免受阿霉素诱导的自噬性损伤。实验表明，OP-D与单糖链皂苷联合使用有助于增强免疫健康，提高白细胞计数和DNA合成，并延长抗体持续时间13。先前研究已发现OP-D具有佐剂效应14。
纳米乳剂是由表面活性剂、油相、助表面活性剂和水组成的水包油型纳米制剂12,15。这类纳米疫苗设计可将抗原和佐剂共同包封，从而增强免疫刺激、保护抗原，并促进树突状细胞（DC）成熟16。在通过筛选获得这些新型佐剂的研发过程中，寻找合适的方法以评估其细胞应答能力至关重要。
本实验方案的目的是系统评估佐剂是否能够增强吞噬作用以及免疫细胞的表达 体外 细胞培养及主要实验方法的详细说明。实验分为四个部分：（1）采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测OP-D和NOD对L929细胞的毒性；（2）通过脾细胞刺激和ELISpot实验检测免疫小鼠体内内分泌因子IFN-γ和IL-17A的水平及其相应细胞数量；（3）利用共聚焦显微镜观察佐剂刺激后树突状细胞（DCs）的抗原呈递能力；（4）检测正常小鼠腹腔巨噬细胞（PMs）与佐剂共培养后上清液中三种细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。
方案
所有细胞实验均在配备基本操作室、缓冲室、无菌培养室以及鉴定与分析室的细胞工程实验室中进行。工作环境和条件无微生物污染及其他有害因素。动物实验遵循《实验动物护理和使用指南》进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。
1. 高压灭菌与材料准备
- 通过高压灭菌（121 °C，20 分钟）进行湿热灭菌，准备试剂和耗材，如磷酸盐缓冲液（PBS）、剪刀、镊子和研磨网。
- 所需试剂和设备详见材料表。空白纳米乳液（BNE）的配方请见表 1。
2. L929 细胞毒性实验
- 打开水浴锅并将温度调节至 37 °C。从液氮中取出一支冻存的 L929 细胞管，在 37 °C 水浴中快速解冻。
- 解冻后立即将细胞用移液器转移至一支 15 mL 无菌离心管中，加入 2 mL DMEM 培养基，并充分混匀。
- 以 129 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。随后加入 2 mL DMEM 重悬细胞，再次以 129 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，加入 6 mL 含 10% FBS 的完全 DMEM 培养基重悬细胞，转移至 T25 培养瓶中，置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中培养 48 小时。
- 弃去培养瓶中的培养基，用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。然后加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶，在 37 °C 下消化 1–2 分钟。
- 当观察到细胞变圆时，立即加入 4 mL 完全 DMEM 培养基终止消化，并充分混匀。随后将细胞吸移至 15 mL 无菌离心管中，以 129 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，用 1 mL 完全 DMEM 培养基重悬细胞。取 20 µL 细胞悬液使用细胞计数板进行细胞计数，并将剩余细胞用完全 DMEM 培养基稀释至 1 × 105 个细胞/mL。
- 向 96 孔板的外围孔中加入 100 µL 超纯水，仅向内侧孔中加入 100 µL 细胞稀释液。将该板置于 37 °C 培养箱中，进行贴壁培养 4 小时。
- 待细胞贴壁后，分别向孔中加入 OP-D 和 NOD，用完全 DMEM 培养基配制终体积为 200 µL/孔（各药物终浓度分别为 480 µg/mL、240 µg/mL、120 µg/mL、60 µg/mL 和 30 µg/mL）。每个浓度设置三个复孔。然后将细胞放回培养箱继续培养 24 小时。
- 用完全 DMEM 培养基将 CCK-8 溶液稀释至 10%，每孔加入含佐剂和细胞溶液的稀释液 100 µL 至 96 孔板中。将板放回培养箱，继续孵育 2–3 小时。
- 加样过程中应频繁混匀细胞悬液，防止因细胞沉淀导致分布不均。在加入 CCK-8 前后均需轻轻振荡培养板数次，以充分混匀培养基与 CCK-8 溶液。
- 使用酶标仪在 450 nm 波长处测定吸光度。设置一个仅含培养基和 CCK-8 的空白孔作为基线吸光度值。作图时，通过从测得的吸光度值中减去空白孔的吸光度值，计算出准确的吸光度值。
- 使用酶标仪检测前应确认各孔中无气泡存在，因为气泡会干扰检测结果。
3. 脾细胞刺激
- 用30 µg蛋白抗原加30 µg佐剂免疫6-8周龄BALB/c小鼠 通过 在第0天、第7天和第14天分别进行一次肌肉注射（200 µL），根据以下实验分组：（1）PBS组，（2）抗原（Ag）组，（3）抗原 + OP-D（Ag/OP-D）组，（4）抗原 + BNE（Ag/BNE）组，（5）抗原 + NOD（Ag/NOD）组，以及（6）抗原 + AlPO4 （Ag/Al）组
- 准备室：初次免疫后第24天，将小鼠从动物房中取出，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（100 mg/kg）实施安乐死。将小鼠置于玻璃皿中，浸入75%酒精浸泡5分钟。
- 将离心管置于离心管架上，对一次性培养皿进行编号，并用10 mL移液器向每个培养皿中加入5 mL PBS。
- 在小鼠左侧腹面中部用剪刀做一个6-8厘米的切口，撕开皮肤，暴露腹壁，找到脾脏的长条状红色组织。
- 用镊子提起脾脏下方的腹膜，剪开后向上翻起以暴露脾脏。用镊子提起脾脏，用眼科剪分离脾脏下方的结缔组织，摘除脾脏。
- 将脾脏置于含有5 mL PBS的培养皿中，用筛网（200目，70 µm）和研磨棒研磨。研磨后，用弯头滴管按照编号将液体转移至15 mL离心管中。
- 在 453 x g 条件下离心液体 g 5分钟。弃去上清液，每管加入3 mL红细胞裂解缓冲液，重悬细胞，并在室温下裂解10分钟。
- 向每支试管中加入 10–12 mL PBS，倒置混匀，于 453 x g 5 分钟后弃去上清液，每支离心管中加入 10 mL PBS，重悬细胞。
- 取每个样本20 µL加入细胞计数板的孔中，使用自动细胞计数仪记录活细胞数量。
- 将样品在 453 x g 条件下离心 g 5分钟，弃去上清液。重悬细胞，稀释至2.5 × 106 细胞/mL，使用RF-10培养基（配方信息见于 表2），每孔加入100 µL，置于96孔板中。
- 用RF-10培养基将抗原稀释至10 µg/mL，每孔加入100 µL，于37 °C、5% CO₂条件下孵育3天2.
- 吸弃各组细胞的细胞悬液，收集于1.5 mL离心管中，于453 x g 20 分钟后，将上清液吸出至洁净的离心管中。
- 严格按照ELISA试剂盒说明书进行IFN-γ和IL-17A含量检测。具体方法与步骤如下。
- 配制1×洗涤缓冲液工作液（随试剂盒提供）、标准品梯度浓度溶液（用试剂盒提供的1×稀释缓冲液R将细胞因子标准品溶液稀释至500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.3 pg/mL和15.6 pg/mL）、生物素化抗体工作液（用试剂盒提供的1×稀释缓冲液R按1:100稀释生物素化抗体溶液，制备成工作液）以及根据需要配制链霉亲和素-HRP工作液。
- 在标准孔中加入100 µL/孔的稀释细胞因子标准品溶液，在样品孔中加入100 µL/孔的样品（样品稀释使用试剂盒提供的稀释缓冲液R [1x]），在空白对照孔中加入100 µL/孔的稀释缓冲液R (1x)。
- 每孔加入50 µL生物素化抗体工作液，充分混匀，用封板膜密封后于37 °C孵育90分钟。
- 从孔中移除液体，每孔加入300 µL 1×洗涤缓冲液工作液。1分钟后弃去孔内液体。重复此步骤4次，每次将液体在滤纸上吸干。
- 每孔加入 100 µL 链霉亲和素-HRP 工作液。盖好后于 37 °C 孵育 30 分钟。将样品在 453 x g 5 分钟后弃去上清液。
注意：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应彻底拍干，直至滤纸上看不到水印为止。 - 每孔加入100 µL TMB，37 °C避光孵育5-30分钟，根据孔内颜色深度（深蓝色）判断终止反应时机。通常显色10-20分钟即可获得理想结果。
- 通过每孔加入100 µL终止液迅速终止反应。反应终止后10分钟内测定450 nm处的吸光度值。
注意：使用前将试剂在室温下平衡30分钟。
4. ELISpot 检测
- 按照上述步骤 3.1–3.10 所述，对小鼠进行免疫并收集脾细胞。严格按照试剂盒说明书进行 IFN-γ 和 IL-17A 的检测。具体方法和操作如下。
- 从密封包装中取出酶标板，用无菌 PBS 洗涤 4 次（200 µL/孔），每孔加入 1640 完全培养基 200 µL，在室温下平衡 2 小时。
- 吸去培养基，用 RF-10 培养基将脾细胞悬液稀释至 2 × 105 个细胞/mL，每孔加入 50 µL 细胞悬液和抗原（终浓度：10 µg/mL）。
- 将酶标板置于含 5% CO2 的 37 °C 恒温湿润培养箱中孵育 48 小时。在此期间不得移动酶标板，并采取措施防止蒸发（例如用铝箔包裹酶标板）。
- 用含 0.5% 胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS-0.5% FBS）将检测抗体（BVD6-24G2-biotin）稀释至 1 µg/mL（1:1,000）（即 0.5 mL 抗体加入 100 mL 缓冲液），每孔加入 100 µL，经 0.22 µm 滤膜过滤后，室温孵育 2 小时。
- 倾去孔内液体，每孔加入 200 µL 1× 洗涤缓冲液，洗涤 5 次，每次静置 30–60 秒，最后一次洗涤后将酶标板倒置在吸水纸上晾干。
- 用 PBS-0.5% FBS 将链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-horseradish peroxidase）稀释 1:1,000，每孔加入 100 µL，室温孵育 1 小时。随后按照步骤 4.6 的方法洗涤酶标板。
- 每孔加入 100 µL 即用型 TMB 底物溶液，显色至清晰斑点出现为止。通过反复用去离子水大量冲洗（冲洗 5–6 次）终止显色反应。如有必要，取下酶标板底部的软塑料层，冲洗膜的下表面。
- 待酶标板干燥后，使用 ELISpot 读板仪或解剖显微镜观察并计数斑点。
5. 树突状细胞的摄取
- 通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死BALB/c正常小鼠。将小鼠浸入75%酒精中5分钟。
- 用剪刀在小鼠腹部下方剪开6-8 cm的切口，夹住切口两端并向不同方向拉开，暴露小鼠腿部。分离小鼠股骨与身体及胫骨与关节的连接，保持股骨两端完整。
- 用剪刀和镊子去除股骨两端关节处的残留组织和软骨。将股骨浸入75%酒精中5分钟，然后转移至无菌PBS溶液中洗涤，以去除表面酒精。
- 用剪刀剪去股骨两端，用无菌PBS溶液在无菌培养皿中冲洗骨髓，并用1 mL注射器抽吸。重复洗涤3至5次。
- 通过细胞筛网（200目，70 µm）过滤，收集骨髓来源树突状细胞（BMDCs）至15 mL离心管中。在290 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，加入4 mL红细胞裂解缓冲液，重悬细胞并在室温下裂解5分钟。
- 加入10 mL无菌PBS溶液以中和裂解液，在290 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
- 将细胞重悬于1 mL含1%青霉素-链霉素溶液和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，进行细胞计数。然后向培养基中加入GM-CSF（20 ng/mL）和IL-4（10 ng/mL），调整细胞浓度至5 × 105/mL，并将细胞接种于盖玻片上。
- 将细胞悬液以每孔2 mL加入6孔板中，置于37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养48小时。培养2天后完全更换培养基，4天后更换一半培养基。
- 在培养第7天，使用倒置显微镜（100倍放大）选择五个状态良好的细胞孔（细胞较大、透亮，细胞表面具有树突状突起）。弃去上清液，每孔加入2 mL用完全DMEM培养基稀释的GFP、OP-D + GFP或NOD + GFP溶液（GFP终浓度：20 µg/mL；佐剂终浓度：10 µg/mL），避光于37 °C孵育30分钟。
- 用PBS洗涤3次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室温孵育15分钟。固定完成后去除多聚甲醛，用鬼笔环肽（phalloidin）和DAPI对细胞染色，终浓度均为10 µg/mL，染色10分钟，随后用PBS洗涤3次。
- 每孔加入1 mL PBS，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察抗原摄取情况，步骤如下：
- 打开CLSM软件，点击ZEN System，等待硬件初始化完成。
- 在定位选项卡中点击GFP 和DAPI 快捷方式，找到可观察区域。关闭荧光光源和透射光。
- 在采集菜单中点击Smart Setup 打开染料库，添加三种荧光染料：EGFP、鬼笔环肽和DAPI。点击Best Signal > OK。在通道选项卡中点击EGFP 通道，点击Live 在右侧界面选择合适的视野。
- 针孔选择1 AU，旋转微调焦螺旋调整焦距，选择合适的焦平面。点击Range Indicator，调节激光功率和主增益组合，使图像中仅出现零星红色点状信号。
- 保持激光功率不变，使用相同参数调节鬼笔环肽和DAPI通道。
- 点击停止Live ，点击Acquisition Mode 更改拍摄参数：帧尺寸：1024像素 × 1024像素；扫描速度：7；平均次数：2x。点击Snap 并选择Split 查看所有采集图像，保存图像。
6. 巨噬细胞活化
- 安乐死后，将 C57BL/6 小鼠浸入 75% 酒精中，并按编号顺序仰面放置于玻璃培养皿中。
- 将小鼠通过传递窗送入无菌操作室，在操作台上静置 5 分钟。
- 用注射器吸取 10 mL 生理盐水，将小鼠身体倾斜约 45° 向下，向腹腔中部注射生理盐水。每注射 10 mL 后，抽出约 5 mL 细胞悬液至 15 mL 离心管中，重复此注射过程 3 次。
- 将细胞悬液在 129 × g 条件下离心 5 分钟，以获得小鼠腹腔原代巨噬细胞。重悬细胞，用 RPMI 1640 完全培养基（含 10% FBS）调整细胞浓度至 2 × 106 个细胞/mL，并将细胞悬液接种于 24 孔板中，确保每孔细胞数量一致（1 mL/孔）。
- 在 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜（约 16–20 小时），随后分别加入 PBS、Ag、Ag/OP-D、Ag/NOD 和 Ag/Al（Ag 终浓度：5 µg/mL；佐剂终浓度：10 µg/mL；总体积：2 mL）孵育 24 小时。采用步骤 3.12–3.19 中所述方法和程序，使用 ELISA 试剂盒检测培养上清液中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的水平。
结果
OP-D和NOD佐剂的细胞活性评价已完成 体外 根据方案。L929成纤维细胞是用于筛选的有用模型 体外 NOD 毒性测试图1). 对脾脏中炎症性细胞因子水平的定量分析有助于研究人员更深入地理解免疫应答过程（图2）。在临床试验中评估抗原特异性T细胞免疫以及筛选疫苗候选物时，ELISpot检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是金标准（图3）。树突状细胞对抗原的摄取增加可引发更强的适应性免疫反应（图4。巨噬细胞在向T细胞呈递抗原方面发挥重要作用，同时可诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分子，从而启动适应性免疫应答（图5）。上述实验结果由 Tong 等发表，不同的抗体反应 体内 以及针对小鼠的保护效率可在原文中找到14.
图1：L929细胞的体外细胞毒性试验。 图中显示了OP-D和NOD在不同梯度浓度（30 µg/mL、60 µg/mL、120 µg/mL、240 µg/mL和480 µg/mL）下与L929细胞共孵育后的细胞毒性效应。检测采用CCK-8试剂盒。统计分析使用统计分析软件进行。两组之间的差异采用非配对双尾Student t检验进行分析。所有数值均表示为均值±标准差（n = 3），显著性差异表示如下：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。该图已根据Tong等14修改。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：脾细胞中IFN-γ和IL-17A的水平。 来自免疫小鼠的脾细胞用抗原刺激3天，通过ELISA检测上清液中细胞因子（A）IFN-γ和（B）IL-17A的水平。结果显示，与Ag/OP-D、Ag/BNE和Ag/Al组相比，Ag/NOD组中IFN-γ和IL-17A的产生显著增加（p < 0.01）。采用统计分析软件进行统计分析，多组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接Tukey多重比较检验。所有数值均表示为均值 ± 标准差（n = 8），显著性差异表示如下：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。本图经Tong等14修改。 请点击此处查看本图的放大版本。
图3：脾细胞群体中分泌IFN-γ和IL-17A的细胞数量。（A）脾细胞中抗原特异性T细胞分泌IFN-γ形成斑点的ELISpot分析。（B）脾细胞中抗原特异性T细胞分泌IL-17A形成斑点的ELISpot分析。与细胞因子结果类似，Ag/OP-D组和Ag/NOD组在脾脏淋巴样T细胞群体中表现出显著升高的IFN-γ和IL-17A形成细胞比例及数量。其中Ag/NOD组诱导的Th1（p < 0.001）和Th17（p < 0.01）免疫反应强于其他各组。统计分析采用统计学分析软件进行，多组间差异通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后接Tukey多重比较检验进行评估。所有数值均以均值±标准差（mean ± SD，n = 8）表示，显著性差异标注如下：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。本图经修改自Tong等14。 请点击此处查看本图的放大版本。
图4：BMDCs摄取抗原的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。 鬼笔环肽将细胞骨架染成红色，DAPI将细胞核染成蓝色，GFP呈现绿色荧光。如图所示，在GFP + OP-D组和GFP + NOD组与BMDCs共孵育30分钟后，CLSM中可观察到绿色荧光，但GFP + NOD颗粒被类似吞噬体的囊泡结构包围，而GFP + OP-D颗粒则无此现象。本图已根据Tong等人的研究进行修改14。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：佐剂配制抗原对腹腔巨噬细胞（PMs）活化的影响。 采用 ELISA 检测在 PBS、Ag、Ag/OP-D、Ag/NOD 和 Ag/Al 存在下与腹腔巨噬细胞共孵育后上清液中细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的浓度。与单独抗原刺激相比，Ag/NOD、Ag/OP-D 和 Ag/Al 刺激均显著增加了腹腔巨噬细胞中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的分泌（p < 0.05）。NOD 组中巨噬细胞的活化程度显著高于 OP-D 组和 AlPO4 组（p < 0.05）。统计分析使用统计学分析软件进行。多组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接 Tukey 多重比较检验进行分析。所有数值均表示为均值 ± 标准差（n = 8），显著性差异表示如下：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。本图经修改自 Tong 等14。 请点击此处查看本图的放大版本。
| 试剂 | 密度 | 质量（每10 g） |
| Cremophor EL-35 | 散装 | 1.92 |
| 甘油 | 散装 | 0.48 |
| GTCC | 散装 | 0.6 |
| 超纯水 | 散装 | 残留量 |
表1：BNE的配方。
| 试剂 | 浓度 | 体积 |
| β- Mercaptoethanol | 50µM | 0.366µL |
| Fetal Bovine Serum | 1X | 10mL |
| Glutamax | 2mM | 1mL |
| Glutamax RPMI 1640 | 1X | 85mL |
| HEPES | 10mM | 1mL |
| Non-essential amino acids(100x) | 1X | 1mL |
| Penicillin-Streptomycin Solution | 100U/mL | 1mL |
| Sodium pyruvate(100 mM) | 1mM | 1mL |
表2：RF-10完全培养基的配制信息。
讨论
亚单位疫苗具有良好的安全性，但免疫原性较差。提高其免疫原性的主要策略是将抗原与佐剂进行物理吸附或偶联，并将其整合到药物递送系统中，以促进树突状细胞（DCs）对抗原的摄取和呈递。天然植物皂苷（如奎拉雅皂苷及其衍生物）具有高毒性，不适合用于人用疫苗的开发17。因此，研究疫苗或佐剂对细胞的毒性作用是评价新型疫苗的必要第一步。
本研究中所采用的方案依据 ISO 10993-5:2009 进行18，这使得样品制备具有一定的灵活性。标准的毒性检测细胞系L929成纤维细胞与牙龈成纤维细胞在细胞毒性水平上相似。然而，L929成纤维细胞已成为一种有效的筛选模型 体外 由于其优异的可重复性，纳米材料的毒性测试19MTT和CCK-8常用于细胞活力和细胞毒性检测。MTT与CCK-8检测结果相互矛盾，且无显著相关性，但CCK-8检测所得细胞活力与MTT检测结果相比具有显著差异。20之前研究中MTT结果的一种可能解释是，在较高MTT浓度下可诱导加速细胞死亡21CCK-8 方法的实验结果通常与动物毒性试验结果基本一致22因此，在新的细胞毒性评价方法出现之前，使用CCK-8法检测OP-D和NOD对L929细胞的毒性可能是目前最佳的选择。该方法也将在疫苗材料及佐剂评价领域持续应用。
脾脏是人体最大的继发性淋巴器官，对脾脏中炎症性细胞因子水平的定量分析有助于我们理解免疫应答过程23。目前认为，小鼠与人类脾脏在结构和细胞类型方面存在一些基本差异24，但由于特定免疫细胞类型及脾脏区域功能的基本相似性，利用小鼠脾脏T细胞开展的研究仍具有相关性24。在本实验方案中，我们采用ELISA试剂盒检测了脾脏中Th1型细胞因子IFN-γ和Th17型细胞因子IL-17A的分泌水平。该检测方法通常用于定量分析，因其使用高亲和力抗体去除非特异性物质，具有较高的灵敏度。本方法的主要局限性在于检测耗时较长且试剂消耗量大。细胞因子也可通过流式细胞术和Luminex技术进行检测，但这些方法需要复杂的仪器设备、昂贵的原材料以及专业培训。因此，这种简便且经济的ELISA试剂盒是测定特异性免疫应答的有力工具。ELISpot已成为测定特定细胞因子分泌细胞（斑点形成细胞）免疫应答最常用的技术之一。它不仅可用于检测疫苗候选物诱导的CD8+ T细胞应答，还可用于免疫后对特异性抗原的识别25。ELISpot具有高通量筛选能力和高灵敏度检测限（1/100,000个细胞），同时兼具可直接观察细胞和快速分析的优点，因而被广泛应用。每个斑点的形成代表单个T细胞或B细胞的活化频率，对疫苗和佐剂引起的细胞免疫应答进行评估具有重要意义，这使得ELISpot在当前仍具有不可替代的地位。
树突状细胞呈递抗原是激发免疫应答的前提条件14树突状细胞（DCs）是介导T细胞免疫应答发育的关键细胞类型之一，其功能包括抗原摄取、迁移至淋巴结以及激活初始T细胞。14考虑到纳米乳液颗粒与细胞膜的相互作用是决定颗粒摄取的关键因素，本实验方案采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测树突状细胞（DCs）内的GFP吞噬情况。已有研究表明，树突状细胞能够高效地将抗原转运至引流淋巴结，这可能是佐剂增强抗原免疫原性的原因。 体内此外，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是该技术最常见的商业化实现方式，广泛应用于成像实验室。其具备光学切片能力、清晰的分辨率以及三维成像的多功能性26 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是分析树突状细胞（DCs）抗原摄取的最佳工具，尽管其无法用于定量数据的采集。
主要组织相容性复合体（MHC I 和 II）在抗原的特异性识别中具有重要作用。MHC II 功能性分子在抗原呈递细胞（APCs）中高表达，可诱导 CD4+ T 细胞的活化。APCs 包括巨噬细胞、树突状细胞（DCs）和 B 淋巴细胞27，它们在调节适应性免疫中发挥重要作用。巨噬细胞广泛分布于宿主免疫系统中，在防御反应和维持内环境稳态中起关键作用28。巨噬细胞的活化对于启动适应性免疫应答至关重要29。同时，与病原体大小相似的纳米乳剂佐剂可促进抗原识别和吞噬作用，激活 NALP3 炎症小体和巨噬细胞，并调节抗原呈递过程28。在本实验方案中，主要使用腹腔巨噬细胞（PMs）作为模型，通过 ELISA 检测促炎性细胞因子 IL-1β 和 Th2 型细胞因子 IL-6 及 TNF-α 的分泌情况，从而定性评估疫苗和佐剂对巨噬细胞的活化能力。然而，其活化的程度及作用机制仍需通过更多实验进一步确定。例如，需进一步研究免疫细胞活化所必需的 EGF、IL-6 等因子是否被分泌，以及相关信号通路（如 JAK-STAT、JNK、PI3K-Akt 等）的激活情况。
总之，一系列用于验证的方案 体外 已建立细胞对新型佐剂的反应评估方法，包括细胞毒性、细胞因子分泌、树突状细胞摄取以及巨噬细胞活化。这些实验方案不仅证明了佐剂具有低毒性及高效的细胞递送能力，还提供了CCK-8、ELISA和ELISpot的详细操作流程。已完成对植物来源免疫增强剂OP-D及其改良型强效纳米乳疫苗佐剂NOD的细胞反应性评估。 体外 且该方案有效。尽管ELISA、ELISpot和共聚焦激光扫描技术传统上已被用于评估 体外 佐剂对细胞免疫原性的评估方法存在诸多缺点，例如检测周期长、工作量大、材料成本高以及需要专业技术人员操作。未来的研究中需采用基因芯片、单细胞测序和转录组学等更为精确的方法和技术，以进一步拓展该技术的应用范围。
披露
作者声明，不存在可能影响本文所报告工作的任何竞争性财务或个人利益。
致谢
本研究得到中国国家重点研发计划项目（编号：2021YFC2302603）、国家自然科学基金项目（编号：31670938、32070924、82041045 和 32000651）、重庆市自然科学基金项目（编号：2014jcyjA0107 和 2019jcyjA-msxmx0159）、重庆市研究生科研与创新项目（编号：CYS21519）、陆军军医大学专项项目（编号：2020XBK24）以及国家级大学生创新创业训练计划项目（编号：202090031021）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96孔滤膜板 | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO₄ | General Chemical Company, USA | null | |
| 自动细胞计数仪 | Countstar, 中国 | IC1000 | |
| BALB/c 小鼠和 C57BL/6 小鼠 | 北京华阜生物科技股份有限公司 | null | |
| 辛酸/癸酸甘油三酯 (GTCC) | 北京丰利医药有限公司，中国北京 | null | |
| CCK-8 试剂盒 | Dojindo, 日本 | CK04 | |
| 细胞计数板 | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| 细胞筛 | biosharp, 中国 | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, 德国 | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM 基础(1x) 培养基 | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X 倒置显微镜 | Nikon, 日本 | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, 印度 | null | |
| ELISpot 经典试剂盒 | AID, 德国 | ELR06 | |
| 胎牛血清 | GIBCO, USA | 10099141C | |
| 多功能微孔板读数仪 | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 培养箱 | Heal Force, 瑞士 | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 细胞系 | FENGHUISHENGWU, 中国 | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss, 德国 | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, 法国 | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, 法国 | 36372K | |
| 小鼠 IFN-γ ELISA 试剂盒 | Dakewe, 中国 | 1210002 | |
| 小鼠 IFN-γ 预包被 ELISPOT 试剂盒 | Dakewe, 中国 | DKW22-2000-096 | |
| 小鼠 IL-17A ELISA 试剂盒 | Dakewe, 中国 | 1211702 | |
| 小鼠 IL-17A ELISpotPLUS 试剂盒 | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| 小鼠 IL-1β ELISA 试剂盒 | Dakewe, 中国 | 1210122 | |
| 小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒 | Dakewe, 中国 | 1210602 | |
| 小鼠 TNF-α ELISA 试剂盒 | Dakewe, 中国 | 1217202 | |
| 非必需氨基酸(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| 麦冬皂苷-D | 成都普瑞科技有限公司 | 945619-74-9 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| 鬼笔环肽 | Solarbio, 中国 | CA1620 | |
| 磷酸盐缓冲液 | ZSGB-BIO, 中国 | ZLI-9062 | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio, 中国 | R1010 | |
| RPMI 1640 培养基 | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| 丙酮酸钠(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| 角鲨烯 | Sigma, USA | S3626 | |
| β- 巯基乙醇 | Invitrogen, USA | 21985023 |
参考文献
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085(2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905(2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569(2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3(2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717(2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525(2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827(2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264(2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410(2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
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