Method Article

Флуоресцентный пожизненный макротомограф для биомедицинских применений

DOI:

10.3791/64321

⸱

April 7th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается использование нового быстрого оптического тепловизора для макроскопической фотолюминесцентной визуализации образцов с длительным распадом. Описаны процедуры интеграции, получения и анализа изображений, а также подготовка и характеристика материалов датчиков для визуализации и применения тепловизора при изучении биологических образцов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлен новый фотолюминесцентный пожизненный тепловизор, предназначенный для картирования концентрации молекулярного кислорода (O 2) в различных фосфоресцирующих образцах, начиная от твердотельных покрытий, чувствительных к O 2 и заканчивая образцами живых тканей животных, окрашенными растворимыми зондами, чувствительными к O2. В частности, был использован зонд ближнего инфракрасного диапазона NanO2-IR на основе наночастиц, который возбуждается светодиодом (LED) с длиной волны 625 нм и излучает на длине волны 760 нм. Система обработки изображений основана на камере Timepix3 (Tpx3Cam) и оптико-механическом адаптере, в котором также находится усилитель изображения. Микроскопия с фосфоресценцией O2 в течение всего срока службы (PLIM) обычно требуется для различных исследований, но современные платформы имеют ограничения в своей точности, общей гибкости и удобстве использования.

Представленная здесь система представляет собой быстрый и высокочувствительный тепловизор, который построен на интегрированном оптическом датчике и чип-модуле считывания Tpx3Cam. Показано, что он производит высокоинтенсивные сигналы фосфоресценции и стабильные значения времени жизни из окрашенных на поверхности образцов кишечной ткани или внутрипросветно окрашенных фрагментов толстой кишки и позволяет детально картировать уровни O2 в ткани примерно за 20 с или менее. Представлены также первоначальные эксперименты по визуализации гипоксии в трансплантированных опухолях у животных, находящихся в бессознательном состоянии. Мы также описываем, как тепловизор может быть перенастроен для использования с чувствительными к O2 материалами на основе красителей Pt-порфирина, используя светодиод 390 нм для возбуждения и полосовой фильтр 650 нм для излучения. В целом, было обнаружено, что тепловизор PLIM производит точные количественные измерения значений срока службы используемых зондов и соответствующие двумерные карты концентрацииO2 . Он также полезен для метаболической визуализации моделей тканей ex vivo и живых животных.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O 2 является одним из ключевых параметров окружающей среды для живых систем, и знание распределения O 2 и его динамики важно для многих биологических исследований 1,2,3. Оценка оксигенации тканей с помощью фосфоресцирующих зондов 4,5,6,7,8 и PLIM 9,10,11,12,13 набирает популярность в биологических и медицинских исследованиях 3,9,14,15,16

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с животными проводились в соответствии с разрешениями, выданными Управлением по регулированию товаров медицинского назначения (HPRA, Ирландия) в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ (2010/63/EU) и были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Университетского колледжа Корка.

1. Пробоподготовка

  1. Окрашивание зондом живых образцов тканей ex vivo
    1. Для применения ex vivo используйте свежевыделенные образцы тканей от 4-недельной самки мышей Balb/c.
    2. В день эксперимента усыпляют мышь путем обезглавливания и быстро рассекают фрагменты толстой ки....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для визуализации ex vivo фрагменты кишечных тканей окрашивали путем местного применения зонда NanO2-IR на серозной стороне ткани. Для более глубокого окрашивания в просвет вводили 1 мкл зонда. В последнем случае стенка кишечника толщиной 0,2-0,25 мм экранировала зонд от камеры. Два процесса окрашивания показаны на рисунке 2А.

Результирующие изображения интенсивности и PLIM представлены на рисунке 2B-G.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Приведенные выше протоколы дают подробное описание сборки нового тепловизора и его работы в микросекундном режиме FLIM/PLIM. Камера нового поколения Tpx3Cam на базе TCSPC в сочетании с оптико-механическим адаптером Cricket с усилителем изображения, эмиссионным фильтром и макрообъективом создает стабильный, компактный и гибкий оптический модуль, которым легко управлять. Было показано, что тепловизор хорошо справляется с рядом различных образцов и аналитических задач, которые включали характеристику фосфоресцирующих матери.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансовая поддержка этой работы со стороны Научного фонда Ирландии, грантов SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 и 18/SP/3522, а также Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) с благодарностью признается.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Светодиод 627 нмParts Expressможет быть заменен на другой светодиод в зависимости от длины волны возбуждения датчика. Используется светодиод 390 нм для красителей Pt-порфирин.
Фильтр излучения 760 & 50 нм EdmundOptics84-788Может быть заменен на другой фильтр в зависимости от длины волны излучения датчика. Б/у 650 ± Полосовой фильтр 50 нм для красителей Pt-порфирин.
Balb/c мышиEnvigo, ВеликобританияBalb/c
Черный ящикThorlabsXE25C9/M
Cricket AdapterPhotonisCricket-2
CT26 cells ATCCCT26. WThttps://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEMSigma-AldrichD0697Также можно использовать другие носители
ImageJ SoftwareImageJБесплатное программное обеспечение для анализа изображений. Можно скачать с: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 ЭОП с люминофорным экраном P47PhotonisPP0360EF
Mini тарелкиSarstedt83.3900.30035 мм диаметр 
Майларовая пластиковая пленка, 75 микрон RS Ireland785-0795Другие пластиковые подложки также могут быть использованы
NanO2-IRотечественногопроизводства н/аЗонд может быть синтезирован по опубликованной методике 'Цыцарев В., Аракава Х., Борисов С., Пумбо Э., Эрзурумлу Р.С., Папковский Д.Б. Визуализация активности метаболизма мозга in vivo с помощью фосфоресцирующего кислород-чувствительного зонда. J Neurosci Methods. 15 июня 2013 г.; 216(2):146-51. DOI: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 25 апр. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178." или предоставлено нашей лабораторией.
Объектив NMV-50M11" 50 ммNavitarДругие объективы, совместимые с адаторами C-mount могут быть использованы
Оптическая макетная платаThorlabsMB1836
Чашки ПетриSarstedt82.1472.001Диаметр 92 мм
Блок питанияTenma72-10495
Генератор импульсовTenmaTGP110
SophyAmsterdam Scientific Instrumentsn/zПредоставлено ASI вместе с программным обеспечением Tpx3Cam
Tpx3CamAmsterdam Scientific InstrumentsTPXCAM
Tri2 Universityof Oxfordn/aFree Time Resolved Imaging можно загрузить с: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation StageThorlabsLT3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  2. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingPhosphorescence Lifetime ImagingOxygen MappingTimepix3 CameraTCSPC ModeAnimal Tissue ImagingNanoparticle Oxygen ProbeImage IntensifierHypoxia ImagingPlatinum Porphyrin Dye

Related Articles