Здесь представлена хирургическая процедура перманентной перевязки левой коронарной артерии у мышей. Эта модель может быть использована для исследования патофизиологии и связанной с ней воспалительной реакции после инфаркта миокарда.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Перевязка левой коронарной артерии: хирургическая мышиная модель инфаркта миокарда
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ишемическая болезнь сердца и последующий инфаркт миокарда (ИМ) является одной из ведущих причин смертности в Соединенных Штатах и во всем мире. Для изучения патофизиологических изменений после инфаркта миокарда и разработки будущих методов лечения необходимы исследовательские модели ИМ. Постоянная перевязка левой коронарной артерии (LCA) у мышей является популярной моделью для исследования сердечной функции и ремоделирования желудочков после ИМ. Здесь мы описываем менее инвазивную, надежную и воспроизводимую хирургическую модель инфаркта миокарда мыши путем постоянного перевязки LCA. Наша хирургическая модель состоит из легко обратимой общей анестезии, эндотрахеальной интубации, не требующей трахеотомии, и торакотомии. Электрокардиография и измерение тропонина должны быть выполнены для обеспечения инфаркта миокарда. Эхокардиография на 28-й день после инфаркта миокарда позволит определить функцию сердца и параметры сердечной недостаточности. Степень фиброза сердца можно оценить с помощью трихромного окрашивания Массона и МРТ сердца. Эта модель инфаркта миокарда полезна для изучения патофизиологических и иммунологических изменений после инфаркта миокарда.
Введение
Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных проблем общественного здравоохранения, которая ежегодно уносит 17,9 миллиона жизней, что составляет 31 процент глобальнойсмертности1. Наиболее распространенным типом сердечно-сосудистой аномалии является ишемическая болезнь сердца, а инфаркт миокарда (ИМ) является одним из основных проявлений ишемической болезни сердца2. ИМ обычно вызывается тромботической окклюзией коронарной артерии из-за разрыва уязвимой бляшки3. Возникающая в результате ишемия вызывает глубокие ионные и метаболические изменения в пораженном миокарде, а также быстрое снижение систолической функции. Инфаркт миокарда приводит к гибели кардиомиоцитов, что в дальнейшем может привести к дисфункции желудочков и сердечной недостаточности4.
Исследования ИМ у пациентов ограничены из-за дефицита тканей, полученных от пациентов с ИМ5. Таким образом, мышиные модели инфаркта миокарда полезны как для изучения механизмов заболевания, так и для разработки потенциальных терапевтических мишеней. Доступные в настоящее время мышиные модели инфаркта миокарда включают модели необратимой ишемии (LCA и методы абляции) и модели реперфузии (ишемия/реперфузия, I/R)6. Постоянное перевязка левой коронарной артерии (LCA) у мышей является наиболее часто используемым методом и имитирует патофизиологию и иммунологию ИМ у пациентов 7,8,9. Постоянный инфаркт миокарда также может быть вызван методами абляции, которые связаны с электрическим повреждением или криотравмой. Методы абляции способны генерировать инфаркт одинакового размера в точном месте10. С другой стороны, образование рубцов, морфология инфаркта и молекулярные сигнальные механизмы могут варьироваться в зависимости от методов абляции10,11. Метод I/R у мышей является еще одной важной моделью ИМ, поскольку он представляет собой клинический сценарий реперфузионной терапии12. Модель I/R связана с такими проблемами, как переменный размер инфаркта, трудности в различении реакций первоначальной травмы и реперфузия6.
Несмотря на широкое распространение, методы лигирования LCA связаны с низкой выживаемостью и послеоперационной болью13. Этот протокол демонстрирует мышиную хирургическую модель ИМ лигирования LCA, которая включает подготовку и интубацию мышей, лигирование LCA, послеоперационный уход и валидацию MI. Вместо использования инвазивной трахеотомии14 в этом методе используется эндотрахеальная интубация. Животное интубируют, освещая ротоглотку с помощью ларингоскопа, что делает процедуру проще, безопаснее и менее травматичной15. Мышь находится на аппарате искусственной вентиляции легких и под изофлурановой анестезией на протяжении всей процедуры. Кроме того, эхокардиография и трихромное окрашивание Массона выполняются для оценки функции сердца и фиброза сердца после ИМ соответственно. В целом, этот метод обеспечивает надежную и воспроизводимую хирургическую мышиную модель ИМ, которая может быть использована для изучения патофизиологии и воспаления после ИМ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Настоящий протокол исследования был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Питтсбурга. Для этих экспериментов использовали восемь (фиктивные n = 4 и MI n = 4) 1-летних самок мышей C57BL/6J весом 24-30 г. Приблизительно 100% и, по крайней мере, 80% мышей выжили в первые 24 ч и 28 дней соответственно.
1. Подготовка и эндотрахеальная интубация мышей
- Разогрейте стерилизатор (см. Таблицу материалов) до 250 °C и поместите в него автоклавные хирургические инструменты на несколько минут.
- Обезболивают мышей в индукционной камере 3% изофлураном и 1 л/мин кислорода в течение 5 мин.
- Обеспечьте глубину анестезии в мыши, проверив реакцию на твердое защемление пальца ноги.
- Взвесьте мышь, чтобы оценить дозировку предоперационного обезболивающего препарата бупренорфина (0,1 мг / кг). Вводят препарат интраперитонально.
- Подстригите шерсть с левой стороны грудной клетки с помощью электрической бритвы.
- После этого трижды продезинфицируйте место операции повидон-йодом и 70% этанолом.
- Поместите мышь в положение лежа на спине на наклонной доске. Закрепите голову и конечности мыши с помощью резинки, прикрепленной к верхним резцам и скотча соответственно. Нанесите стерильную офтальмологическую смазку на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Откройте челюсть и осторожно вытащите язык из ротовой полости.
- Определить отверстие гортани можно, осветив ротоглотку с помощью ларингоскопа (см. Таблицу материалов).
- Отрежьте около 0,5 см от иглы катетера 24 G и вставьте тупую иглу в пластиковый щиток. Направьте тупую иглу с пластиковым щитком в трахею. Выньте иглу, оставив пластиковый щиток в трахее.
- Установите аппарат ИВЛ (см. Таблицу материалов) на частоту дыхания 137 ударов в минуту (оптимизированную для мышей, используемых в этом исследовании) и дыхательный объем 0,18 куб. см. Подсоедините респираторные трубки к экрану катетера и подтвердите правильность интубации, посмотрев на синхронизированное движение грудной клетки с аппаратом искусственной вентиляции легких.
- Отсоедините респираторную трубку от щитка катетера и поместите животное в положение лежа на спине на предварительно нагретую хирургическую доску с регулируемой температурой. Снова подключите мышь к аппарату искусственной вентиляции легких.
2. Постоянная перевязка левой коронарной артерии
- Продезинфицируйте место операции повидон-йодом и 70% спиртом. Наложите стерильную простыню с отверстием размером с четверть в центре, чтобы закрепить место операции. Аккуратно поднимите кожу с помощью щипцов и сделайте небольшой (1,5-2 см) поперечный разрез кожи вдоль линии между большой и малой мышцами левой грудной мышцы с помощью хирургических ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для разреза использовались ножницы, поскольку они обеспечивают необходимый контроль над глубиной и направлением разреза. - Отделите нижележащие грудные мышцы щипцами и рассекающими ножницами. Мышцы были разделены с помощью ретракторов, прикрепленных к эластичным лентам.
- Сделайте разрез в третьем межреберье микроножницами, следуя естественному углу грудной клетки. На этом этапе необходимо проявлять крайнюю осторожность, чтобы предотвратить повреждение сердца и легких.
- Осторожно растяните ребра с помощью ретракторов, чтобы обнажить левый желудочек. Отодвиньте перикардиальный жир в сторону и найдите LCA, который проходит от края левого предсердия к вершине сердца.
- Пас 8-0 нейлоновый шов под LCA с помощью иглодержателя. Перевязывайте LCA двойным узлом, за которым следует второй узел (модифицированный узел хирурга).
ПРИМЕЧАНИЕ: Побледнение нижнего левого желудочка подтверждает успешную перевязку LCA. В дополнение к этому, измерение тропонина, мониторинг ЭКГ (подъем сегмента ST), эхо / in vivo кардиоуправляемая МРТ или микро-КТ также рекомендуются для подтверждения сопоставимых поражений ИМ. - Извлеките ретракторы и вставьте иглу катетера 22 G в грудную полость. Извлеките иглу, оставив кончик пластикового щитка в грудной полости. Закройте грудную клетку нейлоновым швом 4-0.
- Подсоедините шприц к пластиковому экрану 22 G и медленно удалите лишний воздух, попавший в грудную полость, осторожно нажимая на грудную клетку, чтобы установить отрицательное давление воздуха. Снимите пластиковый щиток.
- Закройте кожу нейлоновым швом 4-0.
- Отключите подачу изофлурана. На этом этапе мышь находится на аппарате искусственной вентиляции легких, подающем кислород.
3. Послеоперационный уход
- Выключите аппарат искусственной вентиляции легких, как только начнется спонтанное дыхание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура занимает около 30-35 минут на животное с момента подготовки мышей до этого этапа. - Держите мышь под нагревательной лампой и следите за ней, пока она не проснется. Животное не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
- После операции поместите животное в отдельную клетку и верните его в исходную клетку с другими животными только после того, как оно полностью выздоровеет.
- Ежедневно следите за мышью на наличие любых признаков боли или дискомфорта.
- Продолжайте внутрибрюшинную инъекцию бупренорфина (0,1 мг / кг) каждые 6-8 часов в течение дополнительных 2 дней после операции.
4. Эхокардиографическая оценка
ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиография была выполнена для оценки параметров сердечной недостаточности на 28-й день после ИМ.
- Через 28 дней после операции обезболите мышей 3% изофлураном и 1 л / мин кислорода, нанесите стерильную офтальмологическую смазку на глаза и удалите волосы на груди с помощью крема для удаления волос. Трижды продезинфицируйте область грудной клетки повидон-йодом и 70% этанолом.
- Закрепите анестезированных мышей на платформе визуализации (см. Таблицу материалов) в положении лежа на спине и поддерживайте постоянный уровень анестезии на протяжении всей процедуры, используя носовой конус, подключенный к анестезиологической системе (1% -2% изофлурана и 1 л / мин кислорода).
- Прикрепите четыре лапы к электродам ЭКГ электродным гелем (см. Таблицу материалов). Следите за температурой животного, вставляя ректальный зонд (см. Таблицу материалов).
- Нанесите сканирующий гель (см. Таблицу материалов) на грудную клетку, поместите датчик вертикально, опустите его на парастернальную линию (параллельно грудной клетке) и поверните на 35° против часовой стрелки, чтобы получить вид левого желудочка по длинной оси парастерна.
- Нажмите кнопку визуализации в B-режиме на программном обеспечении для визуализации (см. Таблицу материалов), чтобы получить полный вид сердца по длинной оси. Отрегулируйте размер и яркость затвора и сохраните изображения с помощью «Сохранить клип » или « Сохранить кадр» для последующих измерений16.
- Переключитесь в М-режим (motion-mode) и расположите ось М-режима на уровне сосочковой мышцы. Отрегулируйте размер ворот и нажмите кнопку «Пуск» в режиме M. Сохраните изображения с помощью Save Clip или Save Frame16,17.
- Поскольку процесс получения изображений в режиме 4D автоматизирован, перед получением данных убедитесь, что сигналы ЭКГ и дыхания активны (рис. 1).
- Начните получать данные в B-режиме. Откройте панель 4D-сканирования и запустите 3D-двигатель. Установите параметры изображения на панели 4D-сканирования и нажмите кнопку «Сканировать », чтобы начать сканирование. После просмотра изображений в 2D-представлении загрузите изображения в режим 4D с помощью кнопки «Загрузить в 4D ».
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 показаны репрезентативные активные сигналы ЭКГ и дыхания во время эхокардиографической оценки фиктивных (рис. 1А) и инфаркта миокарда (рис. 1Б). Проверка активных сигналов ЭКГ и дыхания важна перед получением эхокардиографических данных. На рисунке 2 показано эхокардиографическое измерение функциональных параметров сердца через 28 дней после лигирования LCA.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мышиная модель инфаркта миокарда набирает популярность в сердечно-сосудистых исследовательских лабораториях, и в этом исследовании описывается воспроизводимая и клинически значимая модель инфаркта миокарда. Этот протокол улучшает процесс лигирования LCA несколькими способами. Начнем с того, что следует избегать использования инъекционных предоперационных анестетиков, таких как ксилазин/кетамин или пентобарбиталнатрия 14,15. Использовалась только изофлурановая ане...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения (R01HL143967, R01HL142629, R01AG069399 и R01DK129339), премией AHA за трансформационный проект (19TPA34910142), премией за инновационный проект AHA (19IPLOI34760566) и премией за инновационный проект ALA (IA-629694) (в PD).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 22 G игла для катетера | Exel INT | 26741 | Торакоцентез |
| 24 G игла для катетера | Exel INT | 26746 | Эндотрахеальная интубация |
| 4-0 нейлоновый шов | Covetrus | 29263 | Наложение швов на мышцы и кожу |
| 8-0 нейлоновый шов | S& T | 3192 | Лигирование LAD |
| Анестетические испарители | Vet equip | VE-6047 | Анестезиологическая поддержка |
| Монитор физиологии животных | Fujifilm | VEVO 3100 | Мониторинг частоты сердечных сокращений, частоты дыхания и температуры тела |
| Бетадин раствор PBS | Здоровье животных | 11205 | Антиспелик |
| Бупренорфин | Covetrus | 55175 | Анальгетик |
| Диссекционный микроскоп | OMANO | OM2300S-V7 | Бинокль |
| Электрическая бритва | Wahl | 79300-1001M | Гель для бритья |
| Parker Laboratories | W60698L | Электропроводящий гель | |
| Этанол | Decon Laboratories | 22-032-601 | Дезинфицирующий |
| щипцы | FST | 11065-07 | Нержавеющая сталь |
| Марля | Curity | CAR-6339-PK | Стерильная |
| тепловая лампа | Satco | S4998 | Послеоперационный уход |
| Грелка | Kent scientific | Surgi-M | Контроль температуры |
| Стерилизатор горячих шариков | Germinator 500 | 11503 | Стерилизация хирургического инструмента |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | Анестезия |
| Masson’ s набор для окрашивания трихрома | Thermoscientific | 87019 | Измерение сердечного фиброза |
| Микроиглодержатель | FST | 12500-12 | Микроножницы из нержавеющей стали |
| FST | 15000-02 | ||
| Офтальмологическая мазь | Dechra | Puralube Vet | Стерильная офтальмологическая смазка |
| Сканирующий гель | Parker Laboratories | Aquasonic 100 | Водный гель для пропускания ультразвука |
| Ножницы | FST | 14060-11 | Нержавеющая сталь |
| Ларингоскоп для мелких животных | Penn-Century | Модель LS-2-M | Освещение ротоглотки |
| Аппарат искусственной вентиляции легких для мелких животных | Гарвардский аппарат | 557058 | Поддержка аппарата ИВЛ |
| Хирургический свет | Cole Parmer | 41723 | Ширина осветителя (дюймы): 7 |
| Платформа доклинической визуализации Vevo 3100 | Fujifilm | VEVO 3100 | Эхокардиография |
| Программное обеспечение VevoLAB | Fujifilm | VevoLAB 3.2.6 | Анализ данных эхокардиографии |
Ссылки
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254(2021).
- Mendis, S., et al. World Health Organization definition of myocardial infarction: 2008-09 revision. International Journal of Epidemiology. 40 (1), 139-146 (2011).
- Frangogiannis, N. G. Pathophysiology of myocardial infarction. Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2011).
- Smit, M., Coetzee, A., Lochner, A. The pathophysiology of myocardial ischemia and perioperative myocardial infarction. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 34 (9), 2501-2512 (2020).
- Johny, E., et al. Platelet mediated inflammation in coronary artery disease with Type 2 Diabetes patients. Journal of Inflammation Research. 14, 5131(2021).
- Martin, T. P., et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. British Journal of Pharmacology. 179 (5), 770-791 (2022).
- De Villiers, C., Riley, P. R. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).
- Vasamsetti, S. B., et al. Apoptosis of hematopoietic progenitor-derived adipose tissue-resident macrophages contributes to insulin resistance after myocardial infarction. Science Translational Medicine. 12 (553), (2020).
- Fernandez, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. Cryoinjury: a model of myocardial regeneration. Cardiovascular Pathology. 17 (1), 23-31 (2008).
- Lam, N. T., Sadek, H. A. Neonatal heart regeneration: comprehensive literature review. Circulation. 138 (4), 412-423 (2018).
- Heusch, G., Gersh, B. J. The pathophysiology of acute myocardial infarction and strategies of protection beyond reperfusion: a continual challenge. European Heart Journal. 38 (11), 774-784 (2017).
- Srikanth, G., Prakash, P., Tripathy, N., Dikshit, M., Nityanand, S. Establishment of a rat model of myocardial infarction with a high survival rate: A suitable model for evaluation of efficacy of stem cell therapy. Journal of Stem Cells & Regenerative Medicine. 5 (1), 30-36 (2009).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591(2019).
- Muthuramu, I., Lox, M., Jacobs, F., De Geest, B. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. Journal of Visualized Experiments. (94), e52206(2014).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. C. Murine echocardiography and ultrasound imaging. Journal of Visualized Experiments. (42), e2100(2010).
- Li, L., et al. Assessment of cardiac morphological and functional changes in mouse model of transverse aortic constriction by echocardiographic imaging. Journal of Visualized Experiments. (112), e54101(2016).
- Vasamsetti, S. B., et al. Sympathetic neuronal activation triggers myeloid progenitor proliferation and differentiation. Immunity. 49 (1), 93-106 (2018).
- Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: an improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments. (122), e55353(2017).
- Alwardt, C. M., Redford, D., Larson, D. F. General anesthesia in cardiac surgery: a review of drugs and practices. The Journal of Extra-Corporeal Technology. 37 (2), 227-235 (2005).
- Kolk, M. V., et al. LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438(2009).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. -H., McConnell, B. K. Acute myocardial infarction in rats. Journal of Visualized Experiments. (48), e2464(2011).
- Kalogeris, T., Baines, C., Krenz, M., Korthuis, R. Chapter six-cell biology of ischemia/reperfusion injury. International Review of Cell and Molecular Biology. , Academic Press. 229-317 (2012).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of myocardial ischemia and reperfusion injury in mice using surface pad electrocardiography. Journal of Visualized Experiments. (117), e54814(2016).
- Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
- Xu, Q., et al. Protective effects of fentanyl preconditioning on cardiomyocyte apoptosis induced by ischemia-reperfusion in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 50 (2), 5286(2017).
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Leuschner, F., et al. Silencing of CCR2 in myocarditis. European Heart Journal. 36 (23), 1478-1488 (2015).
- Dutta, P., et al. E-selectin inhibition mitigates splenic HSC activation and myelopoiesis in hypercholesterolemic mice with myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1802-1808 (2016).
- Jiang, C., et al. A modified simple method for induction of myocardial infarction in mice. Journal of Visualized Experiments. (178), e63042(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
