Method Article

אוטומציה של בדיקת מיקרוגרעין באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה ובינה מלאכותית

DOI:

10.3791/64549

⸱

January 27th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת מיקרוגרעין (MN) היא בדיקה מבוססת היטב לכימות נזק לדנ"א. עם זאת, ניקוד הבדיקה באמצעות טכניקות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה ידנית או ניתוח תמונה מבוסס תכונות הוא מייגע ומאתגר. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לפיתוח מודל בינה מלאכותית כדי להבקיע את מבחן MN באמצעות נתוני ציטומטריה של זרימת הדמיה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת המיקרוגרעין (MN) משמשת ברחבי העולם גופים רגולטוריים להערכת רעילות גנטית של כימיקלים. הבדיקה יכולה להתבצע בשתי דרכים: על ידי ניקוד MN בתאים בינוקליים חד-פעמיים מחולקים, חסומים ציטוקינזיס או תאים חד-גרעיניים מחולקים במלואם. מבחינה היסטורית, מיקרוסקופ אור היה שיטת תקן הזהב כדי להבקיע את המבחן, אבל זה מייגע וסובייקטיבי. ציטומטריית זרימה שימשה בשנים האחרונות כדי לדרג את הבדיקה, אך היא מוגבלת על ידי חוסר היכולת לאשר חזותית היבטים מרכזיים של תמונות תאיות. ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) משלבת לכידת תמונה בתפוקה גבוהה וניתוח תמונה אוטומטי, ויושמה בהצלחה כדי לרכוש במהירות תמונות של כל אירועי המפתח במבחן MN ולניקוד שלהם. לאחרונה, הוכח כי שיטות בינה מלאכותית (AI) המבוססות על רשתות עצביות קונבולוציוניות יכולות לשמש כדי לדרג נתוני בדיקת MN שנרכשו על ידי IFC. מאמר זה מתאר את כל השלבים לשימוש בתוכנת AI כדי ליצור מודל למידה עמוקה כדי לדרג את כל אירועי המפתח וליישם מודל זה כדי להבקיע נתונים נוספים באופן אוטומטי. תוצאות מודל הלמידה העמוקה של AI משתוות היטב למיקרוסקופיה ידנית, ולכן מאפשרות ניקוד אוטומטי לחלוטין של בדיקת MN על ידי שילוב IFC ו- AI.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת מיקרוגרעין (MN) היא בסיסית בטוקסיקולוגיה גנטית כדי להעריך נזק לדנ"א בפיתוח קוסמטיקה, תרופות וכימיקלים לשימוש אנושי 1,2,3,4. מיקרו-גרעינים נוצרים מכרומוזומים שלמים או מקטעי כרומוזומים שאינם משתלבים בגרעין לאחר החלוקה ומתעבים לגופים קטנים ועגולים נפרדים מהגרעין. לפיכך, MN יכול לשמש כנקודת קצה לכימות נזק לדנ"א בבדיקת גנוטוקסיות1.

השיטה המועדפת לכימות MN היא בתוך תאים בינוקלים שחולקו פעם אחת (BNCs) על ידי חסימת חלוקה באמצעות Cytochalasin-B (Cyt-B). בגרסה זו של הבדיקה, ציטוטוקסיות מוערכת ג....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף נתונים באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה

הערה: עיין ב- Rodrigues et al.16 עם השינויים הבאים, וציין כי ייתכן שיהיה צורך לשנות את אזורי הרכישה המשתמשים ב- IFC ללכידת תמונה מיטבית:

  1. בשיטה שאינה Cyt-B, בצע ספירת תאים באמצעות מונה תאים זמין מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) על כל תרבית מיד לפני התרבית ומיד לאחר תקופת ההחלמה.
  2. אם אתה מפעיל דגימות בציטומטר זרימת הדמיה יחיד של מצלמה, מקם את Brightfield (BF) בערוץ 4. החלף את M01 ב-M04 ואת M07 ב-M01.
    הערה:....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג את זרימת העבודה לשימוש בתוכנת AI ליצירת מודל עבור מבחן MN. המשתמש טוען את קבצי ה- .daf הרצויים לתוכנת ה- AI, ולאחר מכן מקצה אובייקטים למחלקות מודל האמת הקרקעית באמצעות אשכול בסיוע AI (איור 2) ואלגוריתמי תיוג חיזוי (איור 3). לאחר שכל מחלקות מודל האמת הקרקעית אוכלסו במספיק אובייקטים, ניתן לאמן את המודל באמצעות אלגוריתמים RF או CNN. לאחר האימון, ניתן להעריך את ביצועי המודל באמצעות כלים הכוללים היסטוגרמות של התפלגות מחלקות, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה המוצגת כאן מתארת את השימוש באלגוריתמים של למידה עמוקה כדי להפוך את הניקוד של מבחן MN לאוטומטי. מספר פרסומים אחרונים הראו כי כלים אינטואיטיביים ואינטראקטיביים מאפשרים יצירת מודלים של למידה עמוקה לניתוח נתוני תמונה ללא צורך בידע חישובי מעמיק18,19. הפרוטוקול המתואר בעבודה זו באמצעות חבילת תוכנה מונחית ממשק משתמש תוכנן לעבוד היטב עם קבצי נתונים גדולים מאוד ולאפשר יצירת מודלים של למידה עמוקה בקלות. כל השלבים הדרושים ליצירה ואימון של מודלי RF ו- CNN בחבילת תוכנת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מועסקים על ידי Luminex Corporation, חברת DiaSorin, יצרנית ציטומטר זרימת הדמיה ImageStream ותוכנת Amnis AI המשמשת בעבודה זו.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינור צנטריפוגה 15 מ"לFalcon352096
Cleanser - קולטר קלנז 8546931 של בקמן קולטרעם 200 מ"ל של תכשיר ניקוי.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
ColchicineMilliporeSigma64-86-8
מסנן ואקום על בקבוק קורנינג MilliporeSigmaCLS4307690.22 ומיקרו; מסנן m, בקבוק 500 מ"ל
ציטוכלסין BMilliporeSigma14930-96-2בקבוק 5 מ"ג
Debubbler - 70% איזופרופנולMilliporeSigma1.3704מיכל מילוי עם 200 מ"ל של Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)MilliporeSigma67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Sa Salt 1XEMD MilliporeBSS-1006-BPBS Ca++MG++ Free 
סרום בקר עובריHyCloneSH30071.03
פורמלדהיד, 10%, ללא מתנול, Ultra PurePolysciences, Inc.04018זה מה שמשמש לפורמלין 4% ו-1%. אזהרה: פורמלין/פורמלדהיד רעיל בשאיפה ובמקרה של בליעה.  מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור.  עלול לגרום לרגישות בשאיפה או במגע עם העור. סכנת נזק חמור לעיניים.  סכנת סרטן פוטנציאלית.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
מנתח תאי גויאבה מוזהLuminex0500-3115נעשה שימוש במנתח תאי גויאבה מוזה בתצורה סטנדרטית.
Hoechst 33342Thermo FisherH3570תמיסת 10 מ"ג/מ"ל
מניטולMilliporeSigma69-65-8
MEM חומצות אמינו לא חיוניות 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IILuminex, חברת DiaSorin100220נעשה שימוש ב-2 מצלמות ImageStreamX Mark II המצוידות בלייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-642 ננומטר.
תוכנת ניתוח MIFC - IDEASLuminex, a DiaSorin company100220"Image analysis sofware"
התוכנה הנלווית לתוכנת MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC - INSPIRELuminex, a DiaSorincompany 100220"Image acquisition software"
זוהי התוכנה שמפעילה את תוכנת MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AILuminex, חברתDiaSorin100221"תוכנת AI"
זוהי התוכנה המאפשרת יצירת מודלים של בינה מלאכותית לניתוח נתונים
Mitomycin CMilliporeSigma50-07-7
NEAA Blend 100xLonza BioWhittaker13-114E
תמיסת פניקלין/סטרפטומיצין/גלוטמין 100XGibco15070063
אשלגן כלורי (KCl)MilliporeSigmaP9541
שטיפה - מים טהורים במיוחד או מים נטולי יוניםNANAהשתמש בכל מים טהורים במיוחד או מים נטולי יונים.  מלאו את המיכל ב-900 מ"ל שטיפה.
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 בינוני 1xHyCloneSH30027.01
נדן - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-Bזה זהה לתמיסת מלח פוספט 1x  של Dulbecco; Ca++MG++ free.  מלאו את המיכל ב-900 מ"ל נדן.
מים סטרילייםHyCloneSH30529.01
סטריליזטור - 0.4%– 0.7% היפוכלוריטVWRJT9416-1זוהי למעשה 10% אקונומיקה קלורוקס שניתן להכין על ידי דליית אקונומיקה קלורוקס במים. מלאו מיכל עם 200 מ"ל סטרילזר.
בקבוק T25Falcon353109
T75 בקבוקפלקון353136
תאי TK6MilliporeSigma95111735
מיכל מילוי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  2. OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cel....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micronucleus AssayImaging Flow CytometryArtificial IntelligenceConvolutional Neural NetworkGenetic ToxicityAutomated Image AnalysisDeep Learning ModelCell Morphology ClassificationGenotoxicity ScreeningMononucleated Cells

Related Articles