입상 스캐폴드 내에서 입자 분획의 변동성을 최소화하면 재현 가능한 실험이 용이해집니다. 이 작업은 시험관 내 조직 공학 응용 분야를 위해 제어된 입자 분획으로 과립 스캐폴드를 생성하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
마이크로젤은 미세다공성 어닐링 입자(MAP) 스캐폴드의 빌딩 블록으로, 체외 세포 배양 및 생체 내 조직 복구를 위한 플랫폼 역할을 합니다. 이러한 입상 스캐폴드에서 마이크로젤 사이의 빈 공간에 의해 생성된 선천성 다공성은 세포 침윤 및 이동을 가능하게 합니다. 공극률과 입자 분획을 제어하는 것은 MAP 스캐폴드 설계에 매우 중요한데, 이는 다공성이 세포의 생리활성 신호이기 때문입니다. 구형 마이크로겔은 크기 및 형상을 제어하기 위해 마이크로유체 디바이스 상에서 생성될 수 있고, 후속적으로 중합체 네트워크의 파쇄를 방지하는 방법을 사용하여 동결건조될 수 있다. 재수화 시, 동결건조된 마이크로겔은 MAP 스캐폴드에서 제어된 입자 분획으로 이어진다. 마이크로겔 동결건조를 위한 이러한 방법의 구현은 입자 분획이 거대분자 확산 및 세포 확산에 미치는 영향을 보여주는 재현 가능한 연구로 이어졌습니다. 다음 프로토콜은 MAP 스캐폴드에서 입자 분획을 제어하기 위한 마이크로젤의 제조, 동결건조 및 재수화뿐만 아니라 시험관 내 3D 세포 배양을 위한 생체 직교 가교를 통해 마이크로젤을 어닐링하는 방법을 다룹니다.
서론
미세 다공성 어닐링 입자 (MAP) 스캐 폴드는 마이크로 겔 (μgel) 빌딩 블록이 상호 연결되어 벌크 다공성 스캐 폴드를 형성하는 입상 재료의 하위 클래스입니다. 이러한 입상 스캐폴드의 고유한 마이크로아키텍처를 통해 상호 연결된 구형 마이크로겔 사이의 빈 공간에 의해 생성된 타고난 다공성은 가속화된 세포 침투및 이동을 지원합니다1. MAP 스캐폴드의 마이크로겔 빌딩 블록은 화학적 변형2을 갖는 합성 및 천연 중합체 둘 다로부터 제조될 수 있다. 여기에 설명된 방법은 기능성 노르보르넨(NB) 핸들로 변형된 히알루론산(HA) 백본으로 구성된 마이크로젤의 사용을 구체적으로 강조합니다. HA 폴리머의 NB 기능적 핸들은 마이크로겔을 형성하고 이들을 함께 연결하여 MAP 스캐폴드 3,4를 생성하기 위한 클릭 화학 반응을 지원합니다. 마이크로겔을 함께 연결(즉, 어닐링)하기 위해 효소1, 광기반 5,6 및 무첨가 클릭 화학 3,7
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프로토콜
1. 미세 유체 장치 제작
- 소프트 리소그래피
참고: 이 프로토콜은 de Wilson et al.9의 유동 초점 미세유체 장치 설계의 장치 제조를 설명합니다. 그러나 이 프로토콜은 SU-8 웨이퍼의 모든 장치 설계와 함께 사용할 수 있습니다. 웨이퍼는 페트리 접시에 테이프로 붙일 수 있고, 이어서 PDMS가 웨이퍼 피쳐(15)에 부착되는 것을 방지하기 위해 실란화될 필요가 있다.- 폴리디메틸실록산(PDMS) 엘라스토머 베이스와 경화제( 재료 표 참조)를 10:1 비율로 혼합합니다. ~5mm PDMS로 웨이퍼를 덮기 위해 약 100g을 준비합니다. PDMS 혼합물을 웨이퍼에 붓고 데시케이터에서 약 30분 동안 가스를 제거합니다. 모든 기포가 사라지면 60°C의 오븐에 최소 2시간 동안 두어 PDMS를 경화시킵니다.
- 나이프를 사용하여 웨이퍼를 깨지 않고 장치의 매개 변수 주위를 부드럽게 추적하십시오. 그런 다음 웨이퍼에서 PDMS를 조심스럽게 떼어냅니다. 1mm 생검 펀치( 재료 표 참조)를 사용하여 입구 및 출구 채널을 만듭니다.
알림: 미세 유체 장치를 펀칭 할....
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결과
이 프로토콜의 목적은 3D 세포 배양을 위한 제어된 입자 분획뿐만 아니라 생체 직교 가교 구조를 사용한 미세 다공성 어닐링 입자(MAP) 스캐폴드의 제조를 입증하는 것입니다. 먼저, HA는 마이크로겔 형성 및 MAP 스캐폴드를 형성하기 위한 상호 결합 모두에 사용되도록 노르보르넨 펜던트 그룹으로 변형되었습니다. 이러한 방법을 사용하여 HA 반복 단위의 약 31%가 노르보르넨 기능 핸들로 성공적으로 수정되었습니다(그림 1A). 유동 초점 영역(그림 1B)이 있는 미세유체 장치는 직경이 ~50μm 또는 ~100μm인 HA-NB μgel을 생성하는 것으로 나타났습니다(그림 1C, D). 이 작업의 나머지 부분에서 사용된 μgels는 평균 직경이 92μm(Q1 = 79μm, Q3 = 103μm)였습니다(그림 1.......
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토론
HA-NB 마이크로젤의 미세유체 생산은 에멀젼 배치 생산보다 더 좁은 범위의 크기 분포를 갖는 마이크로겔을 생성하는 것으로 나타났다 3,9. 이 프로토콜에 기재된 마이크로겔은 물질 분해를 지지하기 위해 MMP-절단가능한 가교결합제 (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)를 사용하여 제형화하였다. 그러나, HA-NB 마이크로겔은 또한 비분해성인 디티오트레이톨 (DTT)과 같은 대안적인 디티올 링커를 사용하여 가교결합될 수 있다. 유사하게, 다른 광개시제, 예컨대 Irgacure 2959 2-히드록시-4-(2-히드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논은 티올-엔 가교결합을 촉진하기 위해 LAP 대신 HA-NB 전구체에 사용될 수 있다(10). 이들 마이크로겔은 3.5 wt% 전구체 용액의 점도가 마이크로유체 플랫폼6 상의 액적.......
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공개 사항
ARA와 TS는이 기술에 대한 임시 특허를 출원했습니다.
감사의 글
저자는 국립 보건원, 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) 및 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (1R01AI152568)에 감사드립니다. 이 작업은 노스 캐롤라이나 연구 삼각형 나노 기술 네트워크 (RTNN)의 회원 인 듀크 대학교 공유 재료 계측 시설 (SMIF)에서 부분적으로 수행되었으며, 이는 국립 나노 기술 조정 인프라 (NNCI)의 일환으로 국립 과학 재단 (수상 번호 ECCS-2025064)이 지원합니다. 저자들은 실험실의 전 박사후 연구원인 Lucas Schirmer 박사와 세포 배양 실험을 위한 3D 인쇄 장치를 생성하는 데 도움을 준 Ethan Nicklow에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL Luer-Lok 주사기 멸균, 일회용, 폴리카보네이 | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok 주사기 멸균, 일회용, 폴리카보네이 | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | 형광 표지된 테트라진 |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | 합성용 세포 배양 시료 염색 |
| 알루미늄 호일 | VWR | 89107-726 | |
| 플런저가 있는 생검 펀치, 1.0mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| 생검 펀치, 4mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| 무딘 바늘, 23G 0.5", 비멸균, 뚜껑이 있는 | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| 병 상단 진공 필터, 0.22 μ m | Corning | CLS430521 | |
| 염화칼슘 | VWR | 1B1110 | 마이크로 젤 세척 완충액 |
| 용 포지티브 변위 피펫 용 모세관 피스톤 어셈블리, 1000 μ L 최대 용량 | Rainin | 17008609 | |
| 포지티브 치환 피펫용 Capillary-piston 어셈블리, 25 μ L 최대 부피 | Rainin | 17008605 | |
| 용적식 파이펫용 Capillary-piston 어셈블리, 250 μ L 최대 부피 | Rainin | 17008608 | |
| Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL 자동 세포 계수기 | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| 원심분리기 튜브, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| 원심분리기 튜브, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| 클로로포름, ACS 등급, 유리병 | Stellar Scientific | CP-C7304 | 형광 표지 테트라진 |
| 코로나 플라즈마 건의 합성, BD-10A 고주파 발생기 | ETP | 11011 | |
| CryoTube 바이알, 폴리프로필렌, 나사 캡이 있는 내부 나사산 | Nunc | 368632 | |
| D1 마우스 중간엽 세포 | ATCC | CRL-12424 | MAP 겔 배양을 위한 세포주 |
| 예 DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 세포 배양 시료 염색용 |
| 중수소산화물, 99.9 원자% D | Sigma-Aldrich | 151882 | NMR 분광법용 |
| 투석 튜브, 재생 셀룰로오스 멤브레인, 12-14kDa 분자량 컷오프 | Spectra/Por | 132703 | HA-NB 및 HA-Tet |
| 디에틸 에테르 | 정제용 VWR | BDH1121-4LPC | 형광 표지된 테트라진 합성용 |
| 디메틸포름아미드 | 시그마-알드리치 | 277056 | 형광 표지된 테트라진 |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)의 합성을 위해 | TCI-Chemicals | D2919 | HA |
| 디티오트레이톨(DTT) | Thermo Scientific | R0861 | 비분해성 디티올 링커(MMP 절단 펩타이드 대체) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 고포도당, w/ 4500 mg/L 포도당, L-글루타민, 피루브산나트륨 및 중탄산나트륨, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합 | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | 세포 배양 |
| EMS 파라포름알데히드, 과립 VWR | 100504-162 | 4% PFA | |
| 에탄올 절대 제조용(200 프루프) | KOPTEC | 89234-850 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | ATCC | 30-2020 | D1 세포 배양 |
| 가열판 | Kopf Instruments | HP-4M | |
| 혈구계(커버 글라스 포함 | Daigger Scientific | ||
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa 평균 분자량, 박테리아에서 생산 Streptococcus zooepidemicus, 제약 등급, 미생물 오염 < 100 CFU/g, 세균성 내독소 < HA-Tet 합성에는 0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa 평균 분자량이 사용되었지만, 이러한 방법은 다른 분자량에 맞게 조정할 수 있습니다. |
| IMARIS Essentials 소프트웨어 패키지 | Oxford Instruments | N/A | 현미경 이미지 분석 소프트웨어 |
| 주입 펌프, 이중 주사기 | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 지지 실험실 클램프가 있는 실험실 스탠드 | Geyer | 212100 | |
| 액체 질소 | 에어 가스 | NI 180LT22 | |
| 리튬 페닐(2,4,6-트리메틸벤조일)포스피네이 | TCI-Chemicals | L0290 | |
| 동결건조기 | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus는 단종되었지만 이 프로토콜에는 다른 실험실 등급 콘솔 동결 건조기를 사용할 수 있습니다. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | 형광 표지 테트라 |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | HA |
| 마이크로 커버 유리 수정용, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| 미세유체 장치 SU8 마스터 웨이퍼 | FlowJem | 사내에서 만든 맞춤형 디자인 클린 룸 또는 아웃소싱 | |
| 미네랄 오일, 무거운 | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N / A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | HA-NB 합성 |
| 용 포장 테이프 | 스카치 | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | 형광 표지된 테트라 |
| 페니실린-스트렙토마이신 합성용, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | D1 세포 배양 |
| 페트리 접시용, 폴리스티렌, 일회용, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | HMP 세척용 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX 발수 유리 처리 | Grainger | 465D20 | 미세유체 장치 처리를 위한 합성 소수성 처리 솔루션 |
| RGD 펩타이드(Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 고무 밴드 | 스테이플 | 112417 | |
| 염화나트륨 | Chem-Impex | 30070 | 석용 |
| 스팬 80 합성용 | 시그마-알드리치 | 1338-43-8 | |
| 실가드 184 실리콘 엘라스토머 | 전자 현미경 과학 | 4019862 | 폴리디메틸실록산(PDMS) 엘라스토머 미세유체 장치 및 조직 배양 장치 제조용 엘라 |
| 스토머 주사기 필터, Whatman Uniflo, 0.2 μ m PES, 직경 13mm | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD 디지털 현미경 | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | HA-Tet 합성용 |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | 형광 표지 된 tetrazine |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| 트리톤 X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan 블루 솔루션, 0.4 % | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25 %), 페놀 레드 | Fisher Scientific | 25-200-056 | MAP 젤 |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal Diameter = 0.020, Outer 지름 = 0.060 인치 | 토마스 사이언티픽 | 1204G82 | |
| UV 경화 시스템 컨트롤러, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV 경화 헤드, LED 스폿 UV | OmniCure | N/A | |
| UV 조도계, 추적 가능한 | VWR | 61161-386 | |
| 진공 건조기 | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z 시리즈 정밀 유틸리티 나이프 | Elmer's | XZ3601W |
참고문헌
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A.
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