زراعة وتجميد ومعالجة وتصوير عضويات وكرويات كاملة أثناء وجودها في هيدروجيل

ملخص

تصف هذه الدراسة منهجيات زراعة وتجميد وإذابة ومعالجة وتلطيخ ووضع العلامات وفحص كرويات وعضويات كاملة تحت مجاهر مختلفة ، بينما تظل سليمة في هيدروجيل داخل جهاز متعدد الأغراض.

الملخص

أصبحت الكائنات العضوية والكروية ، وهي هياكل متنامية ثلاثية الأبعاد في مختبرات زراعة الخلايا ، معترف بها بشكل متزايد كنماذج متفوقة مقارنة بنماذج الثقافة ثنائية الأبعاد ، لأنها تحاكي جسم الإنسان بشكل أفضل ولها مزايا على الدراسات على الحيوانات. ومع ذلك ، تواجه هذه الدراسات عادة مشاكل في التكاثر والاتساق. خلال العمليات التجريبية الطويلة - مع نقل المواد العضوية والكروية بين أوعية زراعة الخلايا المختلفة ، والماصات ، وأجهزة الطرد المركزي - غالبا ما تتلف هذه الهياكل المتنامية 3D الحساسة والهشة أو تضيع. في النهاية ، تتأثر النتائج بشكل كبير ، لأن هياكل 3D لا يمكنها الحفاظ على نفس الخصائص والجودة. تقلل الطرق الموضحة هنا من هذه الخطوات المجهدة وتضمن بيئة آمنة ومتسقة للعضويات والكروية طوال تسلسل المعالجة بينما لا تزال في هيدروجيل في جهاز متعدد الأغراض. يمكن للباحثين أن ينمووا ، ويتجمدوا ، ويذوبوا ، ويعالجوا ، ويلطخوا ، ويلصقوا ، ثم يفحصون بنية الكائنات العضوية أو الكروية تحت أدوات مختلفة عالية التقنية ، من المجاهر البؤرية إلى المجاهر الإلكترونية ، باستخدام جهاز واحد متعدد الأغراض. تعمل هذه التقنية على تحسين قابلية استنساخ الدراسات وموثوقيتها وصلاحيتها ، مع الحفاظ على بيئة مستقرة ووقائية للهياكل المتنامية 3D أثناء المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التخلص من الخطوات المجهدة يقلل من أخطاء المعالجة ، ويقلل من الوقت المستغرق ، ويقلل من خطر التلوث.

المقدمة

يكمن مستقبل أبحاث الخلايا والعلاج في مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد¹،^2،3. تعمل النماذج العضوية والكروية على سد الفجوة بين التجارب في المختبر والنماذج الحيوانية من خلال إنشاء نماذج أفضل تحاكي نمو جسم الإنسان وعلم وظائف الأعضاء والأمراض⁴،⁵،⁶،⁷،^8،9. ومع ذلك ، فإن قابلية استنساخ وتكرار هذه النماذج لا تزال صعبة. علاوة على ذلك ، فإن التعامل مع هذه الهياكل وحصادها ونقلها وطردها با....

البروتوكول

1. زراعة المواد العضوية والكروية

1. ضع الهيدروجيل على الثلج طوال الليل (في الثلاجة أو غرفة باردة) ليذوب.
2. ضع الجهاز متعدد الأغراض المتاح تجاريا (MD ؛ انظر جدول المواد) في الحاضنة قبل يوم واحد من التجربة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂) للتدفئة.
3. ضع أطراف ماصة معقمة عريضة الأطراف في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 1.1-1.3 في اليوم 0 ، ويجب تنفيذ الخطوات 1.4-1.11 في اليوم الأول.
4. ضع الهيدروجيل على الثلج في غطاء تدفق رقائقي لمدة 15 دقيقة.
   1. اختياري: قم بتخفيف الهيدروجيل في وسط زراعة الخلايا الباردة وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
5. ضع الأنبوب الذي يحت....

النتائج

تمثل هذه المقالة جهازا متعدد الأغراض (MD) ومنهجيات تكميلية للزراعة والتجميد والذوبان والتلوين النسيجي والتلوين الكيميائي المناعي ووضع العلامات المناعية والطلاء ومعالجة المواد العضوية أو الكروية بأكملها بينما لا تزال في هيدروجيل في بيئة واحدة مصممة بشكل فريد. تم تصميم الدراسة الحالية لإعداد كرويات سرطان الكبد HepG2 في 35 قطرة هيدروجيل في 35 MDs. أجريت التجارب في ثلاث نسخ لضمان الدقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيف عضويات الرئة في MDs على أنها مثال لإثبات نتائج المنهجيات الحالية للدراسات العضوية.

<.......

المناقشة

MD ، المكمل للتركيبات والبروتوكولات الموصوفة هنا ، يسهل النمو السريع والعفوي 3D للعضويات والكروية في بيئة أكثر تحكما ويواصل التجربة في نفس الظروف. تبقى العينة في نفس البيئة خلال العملية بأكملها ، ويبقى ما يقرب من 100٪ من البنى المتنامية 3D سليمة في الحاوية. هذا يحسن التجانس أثناء التجارب المتسلسلة ويسمح بفترة استزراع ممتدة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل عدد الخطوات أثناء معالجة المواد العضوية والكروية بشكل كبير مقارنة بسير العمل التقليدي (الشكل 4) ، والذي بدوره يقلل من وقت المناولة والأخطاء ا.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الإيثانول المطلق (EtOH)	8187602500 يخفف Merck		في dH2< / sub>O لصنع محلول 30٪ و 50٪ و 70٪ و 80٪ و 90٪ و 96٪ وتخزينه في RT
Acetone	Merck	8222512500	Store في RT
Alexa fluor Wheat Germ agglutinin و Hoechst   ؛ في محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS)   ؛	Invitrogen	I34406	Image-IT LIVE غشاء البلازما ومجموعة الملصقات النووية ، تخزينها في -20 درجة ؛ C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) الأجسام المضادة متعددة النسيلة المركزة والمخففة	مسبقا Biocare Medical	CP 028	A Store at +4 & deg; C
الأجسام المضادة للألبومين	Abcam	EPR20195	Store عند +4 درجة ؛ C ، التخفيف: 1:50
جسم مضاد مضاد للبيتا جالاكتوزيداز ، دجاج متعدد النسيلة	Abcam	134435	يخزن في +4 درجة ؛ C ، التخفيف: 1:25
مضاد للسيتوكيراتين 5	Abcam	53121	يخزن في +4 درجة ؛ ج ، التخفيف: 1: 100
أرجيناز -1 أرنب أحادي النسيلة مركز ومخفف مسبقا الأجسام المضادة أحادية النسيلة	Biocare Medical	ACI 3058 A ، B	Store عند +4 درجة ؛ C ، التخفيف: 1:50
كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub >)	Sigma	C1016-500G	يذوب في مثبت Karnovsky لصنع 2 ملي مولار CaCl 2< / sub> ؛ تخزين في RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) Abcam		ab228554
أنابيب الطرد المركزي ، 15 مل & nbsp ؛
، 50 مل & nbsp ؛	Nest	602052
خزانة السلامة الميكروبيولوجية من الفئة الثانية Bio II Advance Plus	Telstar	EN12469
CO2< / sub> حاضنة	باناسونيك	KM-CC17RU2
شبكات نحاسية	علوم المجهر الإلكتروني	G100-Cu	أقسام رقيقة جدا موضوعة على الشبكات ؛ 100 خط / بوصة شبكة
مربعة مجفف النقطة الحرجة	Leica	EM CPD300	لتجفيف العينات البيولوجية لتطبيقات SEM في
خليط محلول الكروموجين الأسيتون المطلق DAB / AEC   ؛	متجر Sigma Aldrich	AEC101	عند +4 درجة ؛ C
سكين الماس	Diatome	Ultra 45 درجة ؛ 40-US	استخدم للأقسام الرقيقة جدا ل TEM
ثنائي ميثيل سلفوكسيد للبيولوجيا الجزيئية	Biofroxx	67-68-5
ماصات باستور البلاستيكية التي يمكن التخلص منها	عش
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	41966-029	Store at +4 ° ؛ C
Eosin Y Solution كحولي	مشرق الشريحة	2.BS01-105-1000
راتنج إيبون	Sigma	45359-1EA-F	طقم تضمين الإيبوكسي المتوسط ، يخزن في +4 درجة ؛ C
مصل الأبقار الجنيني مع المقوي المضاف	Pan Biotech	P30-3304	يخزن في +4 درجة ؛
C محلول التجميد (FS)	Cellorama	CellO-F	يخزن عند +4 درجة ؛
C صانع سكاكين زجاجي	Leica	EM KMR3	لصنع سكاكين زجاجية بسمك 8 مم
شرائط سكاكين زجاجية (مقاس 8 مم × 25.4 مم × 400 مم)	Leica	7890-08	استخدم للأقسام فائقة أو شبه رقيقة للمحلول
المائي TEM Glutaraldehyde ، درجة EM ، 25٪ & nbsp ؛	علوم المجهر الإلكتروني	16210	تمييع في dH2< / sub>O لصنع محلول 2.5٪ وتخزينه عند +4 درجة ؛ محلول
الجلسرين	C Sigma Aldrich	56-81-5	يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، التخفيف: 1:100
المضاد الثانوي IgY (H + L) المضاد للماعز المضاد للدجاج (H + L) ، Alexa ، 647	Invitrogen	A32933	Store at RT
Goat المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، DyLight ، 488	Invitrogen	35502	Store at +4 ° ؛ ج,  التخفيف: 1:50
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، DyLight ، 550	Invitrogen	84540	يخزن عند +4 درجة ؛ ج,  التخفيف: 1:50
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، DyLight ، 488	Invitrogen	35552	يخزن عند +4 درجة ؛ ج,  التخفيف: 1:50
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، DyLight ، 550	Invitrogen	84541	يخزن عند +4 درجة ؛ ج
هيماتوكسيلين هاريس	شريحة مشرقة	2.BS01-104-1000
خلايا HepG2	ATCC	HB-8065	تخزينها في خزان النيتروجين
الإنسان / الفئران OV-6 الجسم المضاد أحادي النسيلة الفأر IgG1 استنساخ # OV-6	R &	أنظمة MAB2020	تخزين في -20 درجة ؛ C
Hydrogel	Corning	354248	Matrigel ، مصفوفة غشاء القاعدي عالية التركيز (HC) ، خالية من LDEV ، 10 مل ، تخزينها عند -20 درجة ؛ C
Hydrogel	Corning	354234	Matrigel ، مصفوفة غشاء القاعدية ، خالية من LDEV ، 10 مل ، تخزينها عند -20 درجة ؛ C
Hydrogel	ThermoFischer Scientific	A1413201	Geltrex ، مصفوفة غشاء أساسي منخفض عامل النمو الخالي
LDEV هيدروجيل	Biotechne ، R & D Systems	BME001-01	Cultrex Ultramatrix RGF BME ، يخزن في -20 درجة ؛ C
		كارنوفسكي	٪ 2 PFA ، ٪ 2.5 جلوتارالديهايد في 0.15 م كاكوديلات عازلة ، 2 ملي كاستوريد الكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي > تحضير طازج ؛ استخدم ل TEM & عينات SEM
حمض الأسبارتيك L-Aspartic	Sigma	11189-100G	يخزن في
RT محلول			قم بإذابة 40 مجم حمض الأسبارتيك في 10 مل DDH2< / sub>O وأضف 66 مجم نترات الرصاص. يستقر الحل عند 60 درجة ؛ C وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5 ؛ تحضير نترات الرصاص
	الطازجة علوم المجهر الإلكتروني	17900	المتجر في RT
Leica مجهر متحد البؤر	Leica	DMi8
LSM 700 مجهر متحد البؤر بالليزر	Zeiss
Microplate	Biotek Synergy
متعدد الأغراض (MD)	Cellorama	CellO-M
صبغة الحمض النووي	النووي Invitrogen	H3569	Hoechst 33258 ، خماسي الهيدرات (مكرر بنزيميد) - محلول 10 مجم / مل في الماء ، يحفظ في +4 درجة ؛ C
صبغة الحمض النووي	ThermoFischer Scientific	62248	محلول DAPI ، يخزن في +4 درجة ؛ C
رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4< / sub>) ، 4٪	علوم المجهر الإلكتروني	19190	تمييع في dH 2< / sub>O لصنع محلول 2٪ ؛ تخزين في +4 درجة ؛ C وفي حاوية محكمة الإغلاق. حماية الضوء
Ov6 الأجسام المضادة	R & أنظمة	D MAB2020	تخزين عند +4 درجة ؛ C
محلول بارافورمالدهايد (PFA) ، 4٪   ؛	سيجما	1.04005.1000	قم بإذابة 4٪ PFA في dH2< / sub>O ويغلي ويبرد ويخزن في درجة حرارة -20 درجة ؛ C
محلول بارافورمالدهايد 4٪ في PBS ، 1 لتر	سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية	sc-281692	مخزن في +4 درجة ؛ C
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، أقراص	MP Biomedicals، LLC	2810305
محلول			٪ 2 OsO4< / sub> ، ٪ 2.5 فيروسيانيد البوتاسيوم في dH 2< / sub>O ؛ تحضير
محلول مائي طازج من فيروسيانيد البوتاسيوم ، 5٪ & nbsp ؛	علوم المجهر الإلكتروني	26603-01	مخزن في RT
Primovert - مجهر المجال الساطع المقلوب - ZEISS	Zeiss	رقم الصنف: 491206-0001-000
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القاع المستدير ، 2 مل	Nest	620611
المسح المجهري الإلكتروني مع مرفق STEM	Zeiss	GeminiSEM 500	نستخدم كاشف الإلكترون الثانوي Inlens (SE) عند 2-3 كيلو فولت لمسح الصور المجهرية الإلكترونية وكاشف aSTEM عند 30 كيلو فولت للإرسال المجهري الإلكتروني.
SensiTek HRP حزمة مختبر مضادة للتكافؤ	ScyTek Laboratories	SHP125	مخزن عند +4 درجة ؛ C
عازلة كاكوديلات الصوديوم ، 0.4 م ، درجة الحموضة 7.2	علوم المجهر الإلكتروني	11655	تمييع في dH 2< / sub>O لصنع 0.2 متر وتخزينها عند +4 درجة ؛ C
صوديوم / بوتاسيوم ATPase alpha 1 الأجسام المضادة [M7-PB-E9]	GeneTex	GTX22871	يخزن عند -20 ° C
محلول لوضع العلامات المناعية (S-IF)	Cellorama	CellO-IF	يخزن في +4 درجة ؛ C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)	Cellorama	CellO-P	Store عند +4 درجة ؛
جهاز تشذيب العينات	Leica	EM TRIM2	لإعداد كتلة عينة epon إلى طلاء الرش الفائق الميكروتوم
	Leica	EM ACE200	قم بتغطية عينات SEM بذهب / بلاديوم 6 نانومتر لمدة 90 ثانية
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma	223220-5G	تمييع في dH 2< / sub >O لصنع محلول 0.5٪ وتصفية ب 0.22 & micro ؛ مرشح غشاء م متجر في RT ؛ تحضير
محلول تريبان الأزرق الطازج ، 0.4٪	Gibco	15250061
Ultra gel Super Glue	Pattex	PSG2C	لكتلة epon المبلمرة بالغراء مع عينة لحامل كتلة epon
Ultramicrotome	Leica	EM UC7	لإعداد أقسام عالية الجودة فائقة أو شبه رقيقة للفحص المجهري الإلكتروني (TEM) أطراف
ماصة عالمية ، 10 & micro ؛ L	Nest	171215-1101
أطراف ماصة عالمية ، 1000 & micro ؛ L	Isolab	L-002
أطراف ماصة عالمية ، 200 & micro ؛ L	عش	110919HA01
المجهر	لخلات اليورانيل	22400	تمييع في dH2< / sub>O لصنع محلول 2٪ وتصفية مع 0.22 & ميكرو ؛ مرشح غشاء م احتفظ بمخزن حاويات مغلق بإحكام في RT

أنابيب الطرد المركزي Nest 601051 الجسم D من مثبت أسبارتات الرصاص جهاز ما بعد التثبيت C علوم الإلكتروني