Il presente protocollo descrive le capacità e le modalità di coltura essenziali dell'Open-Top Organ-Chip per il successo della creazione e della maturazione di colture organo-on-chip a tutto spessore di tessuti primari (pelle, alveolo, vie aeree e intestino), fornendo l'opportunità di indagare diversi aspetti funzionali dell'interfaccia di nicchia epiteliale/mesenchimale e vascolare umana in vitro.
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Articolo metodologico
Ricostituzione della citoarchitettura e della funzione dei tessuti epiteliali umani su un chip d'organo open-top
In questo articolo
Sommario
Abstract
Quasi tutti gli organi umani sono rivestiti con tessuti epiteliali, comprendenti uno o più strati di cellule strettamente collegate organizzate in strutture tridimensionali (3D). Una delle funzioni principali degli epiteli è la formazione di barriere che proteggono i tessuti sottostanti da insulti fisici e chimici e agenti infettivi. Inoltre, gli epiteli mediano il trasporto di nutrienti, ormoni e altre molecole di segnalazione, spesso creando gradienti biochimici che guidano il posizionamento cellulare e la compartimentazione all'interno dell'organo. A causa del loro ruolo centrale nel determinare la struttura e la funzione degli organi, gli epiteli sono importanti bersagli terapeutici per molte malattie umane che non sono sempre catturate dai modelli animali. Oltre alle ovvie differenze tra specie, condurre studi di ricerca sulla funzione barriera e sulle proprietà di trasporto degli epiteli negli animali è ulteriormente aggravato dalla difficoltà di accedere a questi tessuti in un sistema vivente. Mentre le colture cellulari umane bidimensionali (2D) sono utili per rispondere a domande scientifiche di base, spesso producono scarse previsioni in vivo . Per superare questi limiti, nell'ultimo decennio, una pletora di piattaforme biomimetiche microingegnerizzate, note come organs-on-a-chip, sono emerse come una promettente alternativa ai tradizionali test in vitro e sugli animali. Qui, descriviamo un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una piattaforma progettata per modellare tessuti epiteliali specifici dell'organo, tra cui pelle, polmoni e intestino. Questo chip offre nuove opportunità per ricostituire l'architettura multicellulare e la funzione dei tessuti epiteliali, compresa la capacità di ricreare una componente stromale 3D incorporando fibroblasti tessuto-specifici e cellule endoteliali all'interno di un sistema meccanicamente attivo. Questo Open-Top Chip fornisce uno strumento senza precedenti per studiare le interazioni epiteliali/mesenchimali e vascolari a più scale di risoluzione, dalle singole cellule ai costrutti tissutali multistrato, consentendo così la dissezione molecolare della diafonia intercellulare degli organi epitelializzati in salute e malattia.
Introduzione
Storicamente, gli scienziati hanno fatto affidamento sulla sperimentazione animale preclinica per la scoperta di farmaci, ma un numero crescente di questi metodi è stato messo in discussione a causa della scarsa correlazione con il risultato umano1. L'attuazione dei principi delle "3R" per sostituire, ridurre e perfezionare la sperimentazione animale esorta gli scienziati a trovare nuovi metodi alternativi in vitro per supportare la valutazione preclinica del rischio tossicologico e chimicologico2. Tuttavia, molti modelli in vitro sviluppati fino ad oggi mancano dell'architettura biologica, della comple....
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Protocollo
I colonoidi umani sono stati ottenuti da resezioni intestinali in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'ospedale pediatrico di Cincinnati (IBC 2017-2011).
1. Attivazione della superficie
- Preparazione del buffer di attivazione
- Posizionare il reticolante e i reagenti tampone solvente sotto l'armadio di biosicurezza (BSC) e lasciarli equilibrare a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti prima dell'uso.
- Ricostituire 5 mg di reticolante in 5 mL del tampone solvente utilizzando un contenitore sterile impermeabile alla luce o un tubo conico trasparente da 15 m....
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Risultati
Micropatterning superficiale
Il micropatterning della matrice extracellulare (ECM) può essere utilizzato per replicare la configurazione spaziale dell'interfaccia della cripta intestinale. La configurazione Open-Top Chip può essere modificata per integrare timbri microstrutturati specificamente progettati per imitare la topografia naturale dell'interfaccia epitelio-stroma del colon (Figura 6A,B) e delle cripte intestinali su scala micrometrica (Figura 6C-E
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Discussione
L'Open-Top Chip rappresenta una piattaforma abilitante per studiare la complessa interazione cellulare che si verifica tra endotelio, stroma ed epitelio in un microambiente controllato, in tempo reale. Questa tecnologia offre vantaggi critici rispetto alle colture organotipiche e organoidi convenzionali, come l'integrazione di segnali fisici e biochimici rilevanti per ricostituire il microambiente del tessuto umano, tra cui taglio fluidico (flusso), allungamento ciclico e ricostruzione della topografia della superficie e.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano i seguenti interessi finanziari/relazioni personali, che possono essere considerati come potenziali interessi concorrenti: Varone Antonio è un ex dipendente di Emulate Inc. e può detenere partecipazioni in Emulate.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medio; Stroma |
| Ago calibro 18 | MicroGroup | 316H18RW | Tubo in acciaio inox 316 saldato, 18RW Full Hard |
| Ago calibro 19 | MicroGroup | 316H19RW | Tubo in acciaio inox 316 saldato, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tubo, 0,25 mm, 12/confezione |
| 70% etanolo e salviette | - | - | Per la sterilizzazione delle superfici |
| 8-Bromoadenosina 3′,5′-sale sodico monofosfato ciclico (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Integratore medio |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenina | Sigma | A9795 | |
| DMEM/F12 avanzato | Celle | Thermo 12634010 | |
| Lifeline Cell Technology | FC-0016 | ||
| Foglio di alluminio | - | - | - |
| Cellule alveolari | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Anticorpo monoclonale di topo [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Anticorpo monoclonale di coniglio [EPR3747] |
| Anti-acquaporina5 | ABCAM | ab92320 | Anticorpo monoclonale di coniglio [EPR3747] |
| Tubulina anti-beta IV | ABCAM | ab11315 | Anticorpo monoclonale di topo [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Anticorpo monoclonale di topo [JC/70A] |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Coniglio ricombinante monoclonale [AY1E6] |
| Anti-citocheratina 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Anticorpo monoclonale di topo (DE-K10) |
| Anti-citocheratina 14 | ABCAM | ab7800 | Anticorpo monoclonale di topo |
| Anti-E-Caderina | ABCAM | ab1416 | Anticorpo monoclonale di topo |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-HTI-56 | Terrazza Biotech | TB-29AHT1-56 | Anticorpo monoclonale di topo (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrazza Biotech | TB-27AHT2-280 | Anticorpo monoclonale di topo (IgM) |
| Anti-involucrina | ThermoFisher | MA5-11803 | Anticorpo monoclonale di topo (SY5) |
| Anti-Isoforme TA p63-&alfa;, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Anticorpo monoclonale di topo [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-Maturo SP-B | Sette Colli | WRAB-48604 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-Mucina-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Anticorpo monoclonale di topo (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Anticorpo monoclonale di topo p63 Proteina (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-podoplanina (AT-1&alfa;) | ABCAM | ab128994 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-Pro + Proteina Tensioattivo Maturo B | ABCAM | ab40876 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-tensioattivo C | Sette Colli | WRAB-9337 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-Uteroglobina/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Anticorpo monoclonale di topo [AY1E6] |
| Anti-VE-caderina | ABCAM | ab33168 | Anticorpo policlonale di coniglio |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Anticorpo monoclonale di topo [1A12] |
| Acido ascorbico | Sigma | A4544 | |
| Pipette di aspirazione | Corning / Falco | 357558 | 2 mL, polistirolo, confezionato singolarmente |
| Punte di aspirazione | - | - | Sterile (autoclavato) |
| B27 | |||
| BSA (10X) in soluzione PBS | ThermoFisher | 37525 | Agente bloccante |
| Cloruro di calcio | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagene I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagene I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (ECM vascolare) |
| Collagene IV | Sigma | C5533 | |
| Collagene-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagene da placenta umana, 5 mg in polvere, ricostituito a 1 mg/mL |
| Fibroblasti del colon | Biologici cellulari | H6231 | |
| Cellule endoteliali microvascolari del colon | Cell Biologics | H6203 | |
| Tubi conici | - | - | 15 ml e 50 ml in polipropilene, sterile |
| Reticolante (ER-1) | Emulare | 10461 | 5 mg di polvere |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dilattato) | ThermoFisher | D3571 | Sonda DNA |
| Fibroblasti dermici | ATCC | PCS-201-010 | |
| Cellule endoteliali microvascolari dermiche | ATCC | CRL-3243 | |
| Desametasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | ||
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | Codice 10565-018 | Terreno basale per ALI medio |
| Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Anticorpo secondario anti-topo asino |
| Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Anticorpo secondario anti-topo asino |
| Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Anticorpo secondario anti-topo asino |
| Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Anticorpo secondario anti-topo asino |
| Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Anticorpo secondario anti-topo asino |
| Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Anticorpo secondario anti-topo asino |
| Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (senza Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Fattore di crescita epidermico (EGF) umano, ricombinante in E. coli | PromoCell | C-60170 | Integratore di terreno |
| F-12 Ham' s | Invitrogen | 21700-108 | Per ECM vascolare |
| FibriCol | BioMatrix avanzato | 5133-20ML | Soluzione di collagene-I (10 mg/mL) |
| Fibronectina | Corning | 356008 | |
| Fibronectina, umano, naturale, | Corning | 47743-654 | fibronectina plasmatica umana |
| Pinzette di precisione a punta fine | Aven | 18056USA | Pinzetta di precisione Technik Style 5B-SA in acciaio inossidabile |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | ||
| IgG H& L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Anticorpo secondario anti-topo di capra |
| Capra Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Anticorpo secondario anti-topo di capra |
| Capra Anti-Topo IgG H& L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Anticorpo secondario anti-topo di capra |
| Capra Anti-Topo IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Anticorpo secondario IgG1 anti-topo di capra |
| Capra Anti-Topo IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Anticorpo secondario IgM anti-topo di capra |
| Aspiratore a vuoto portatile | Corning | 4930 | - |
| Siero HyClone FetalClone II inattivato a caldo (FCS) | Emocitometro GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| - | - | - | |
| Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo 15630080 | ||
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Colonoidi umani | Ottenuti da resezioni | cliniche Ottenuti da resezioni cliniche | |
| Proteina ricombinante EGF umana | Thermo | PHG0311L | |
| fattore di crescita epiteliale umano | Termo | ||
| Siero HyClone FetalClone II (Stati Uniti) | GE Healthcare | SH30066.02HI | FBS sterile inattivato a caldo |
| Idrocortisone 21-emiuccinato sale sodico | Sigma | H4881 | |
| Idrocortisone | PromoCell | C-64420 | Integratore medio |
| Secchiello per il ghiaccio | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Pompa peristaltica digitale a bassa velocità; q24-Channel (1 per 12 chip) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Fattore di crescita dei cheratinociti (KGF), noto anche come fattore di crescita dei fibroblasti basici 7 (FGF-7), umano, ricombinante in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Cheratinociti | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminina | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminina, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | laminina umana ricombinante 521 |
| Fibroblasti polmonari | cellulari biologici | H6013 | |
| Fibroblasti polmonari | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Cellule endoteliali microvascolari polmonari | Lonza | CC-2527 | |
| Cellule muscolari lisce polmonari | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Contatore manuale | - | - | - |
| Tubi di trasferimento Masterflex (TPE) | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" |
| OD Medium 199, senza rosso fenolo | Thermo | ||
| Provetta per microcentrifuga | - | - | 1,5 ml, sterile |
| Microscopio (con fotocamera) | - | - | Per l'imaging in campo chiaro |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetil cisteina | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T terreno condizionato) | Sigma | N17001 | |
| Siero di capra normale | ThermoFisher | 50062Z | Soluzione bloccante |
| O-fosfosriletanolammina | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldeide (4% in peso/vol) | EMS | 15710 | Agente fissante |
| Penicillina Streptomicina | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillina-streptomicina | Sigma | P4333 | 10.000 U/mL; 10 mg/mL |
| Puntali per pipette | - | - | P20, P200 e P1000 Pipetta sterile a bassa adesione |
| Gilson | F167380 | P20, P200 e P1000 | |
| PluriQ Serum Replacement (o in alternativa KO Serum replacement) | AMSBIO (o Thermo) | N/A (o C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated glass slides | Sigma | P0425 | Vetrini |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Montaggio antisbiadimento con DAPI |
| Acido retinoico | Sigma | R2625 | |
| ROCK inibitore (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondina (HEK293T terreno condizionato) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots integratori | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Terreno di crescita delle cellule epiteliali delle piccole vie aeree BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Integratori medi |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Pipette sierologiche | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL e 25 mL di endotossina bassa, sterile. |
| Terreno di crescita delle cellule epiteliali delle piccole vie aeree (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Tampone solvente (ER-2) | Emulare | 10462 | Flacone da 25 mL |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Tubo conico filtrante sterile |
| Sterilin 100 mm Piastre di Petri quadrate | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chip |
| Palloni T25 | - | - | - |
| Palloni T75 | - | - | - |
| Tri-iodotironina | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0,3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Agente di permeabilizzazione |
| Blu di tripano | Sigma | 93595 | Soluzione allo 0,4% |
| Soluzione TrypEE | Sigma | 12604013 | Soluzione per il distacco delle cellule |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Agente di permeabilizzazione |
| Forno a luce UV (frequenza di picco 365nm, intensità di 100 & micro; J/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Modello CL-1000L |
| Configurazione del vuoto | - | - | Pressione minima: -70 kPa |
| Fattore di crescita dell'endotelio vascolare 165 (VEGF-165) umano, ricombinante in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Integratore medio |
| Fattore di Von Willebrand coniugato FITC | ABCAM | ab8822 | Anticorpo policlonale di pecora |
| Bagnomaria (o perline) | - | - | Impostato su 37 ° C |
| Wnt3A (L-Wnt3A fluido condizionato) | ATCC | CRL-2647 |
Riferimenti
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L.
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Ristampe e permessi
