荧光共振能量转移（FRET）是一种用于在活细胞中检测蛋白质相互作用的成像技术。本文介绍了一种FRET实验方案，用于研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用，后者可将这些酶招募至靶启动子，从而在植物组织中实现基因表达的表观遗传调控。
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本文内容
摘要
摘要
基因表达的表观遗传调控通常受到组蛋白修饰酶（HMEs）的影响，这些酶分别产生异染色质或常染色质相关的组蛋白标记，从而介导转录抑制或激活。HMEs 通过转录因子（TFs）被招募至其靶向的染色质区域。因此，检测并表征 HMEs 与 TFs 之间的直接相互作用，对于更深入理解其功能与特异性至关重要。若此类研究在更接近生理条件的体系中进行，则将具有更高的生物学相关性 体内 在活体组织内。本文描述了一种利用荧光共振能量转移（FRET）技术在植物叶片中可视化植物组蛋白去泛素化酶与植物转录因子之间相互作用的实验方案，该技术可用于检测蛋白质分子间距离在 <彼此相距10 nm。本文介绍了FRET技术的两种变体：SE-FRET（敏化发射）和AB-FRET（受体漂白），其中能量通过非辐射方式从供体转移至受体，或在受体发生光漂白后由供体以辐射方式发射。SE-FRET和AB-FRET两种方法均可轻松适用于发现其他蛋白质之间的相互作用。 在植株中.
引言
植物组蛋白去泛素化酶通过组蛋白的翻译后修饰，特别是通过擦除其单泛素化标记，在调控基因表达中发挥重要作用1。迄今为止，OTLD1 是少数几个在分子水平上被表征的拟南芥（Arabidopsis）植物组蛋白去泛素化酶之一2,3。OTLD1 可从 H2B 组蛋白分子上移除单泛素基团，从而促进靶基因染色质中 H3 组蛋白的常染色质乙酰化和甲基化修饰的去除或添加4,5。此外，OTLD1 还与另一种染色质修饰酶——组蛋白赖氨酸去甲基化酶 KDM1C 相互作用，共同影响靶基因的转录抑制6,7。
大多数组蛋白修饰酶缺乏DNA结合能力，因此无法直接识别其靶基因。一种可能的机制是，这些酶与能够结合DNA的转录因子蛋白协同作用，由转录因子结合这些酶并将其引导至染色质上的特定靶位点。具体而言，在植物中，已知多个主要的组蛋白修饰酶（例如组蛋白甲基转移酶8,9、组蛋白乙酰转移酶
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方案
Nicotiana benthamiana、Agrobacterium tumefaciens 菌株 EHA105 或 GV3101 被用于本研究。
1. FRET 载体构建
- 为供体/受体FRET对选择荧光标签。
- 使用 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 中的 EGFP15,28 （参见 材料表）以构建供体质粒。
- 使用 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 中的 mRFP（参见 材料表）以生成受体载体。
- 使用位点特异性重组克隆技术构建供体/受体FRET载体34，例如 Gateway 重组克隆系统35.
- 扩增目的蛋白的编码序列36 （即拟南芥 OTLD1 和 LSH10)15.
注意：使用一个代表相互作用蛋白之一的同源蛋白但预....
- 扩增目的蛋白的编码序列36 （即拟南芥 OTLD1 和 LSH10)15.
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结果
图2展示了SE-FRET实验的典型结果，其中细胞核在三个通道中同时被记录（即供体GFP、受体mRFP和SE-FRET）。这些数据用于生成以伪彩色标度编码的SE-FRET效率图像。在此标度上，颜色从蓝色向红色的转变对应于FRET效率的升高，表示蛋白质间接近程度从0%到100%的变化。在此代表性实验中，SE-FRET信号在细胞核内被检测到，其在共表达LSH10和OTLD1后的强度与mRFP-GFP表达后观察到的信号相当（即阳性对照）。在阴性对照中未观察到SE-FRET信号（即OTLD1-mRFP与LSH4-GFP共表达，或游离mRFP与LSH10-GFP共表达）。
使用AB-FRET定量分析LSH10与OTLD1之间的相互作用。为此，在光漂白受体mRFP前后记录细胞核中供体GFP的荧光信号，获得供体与受体荧光测量的光漂白时间序列（补充图4）。记录的细胞核图像以伪彩形式呈现，以量化GFP荧光的变化。图3显示，在共表达LSH10-GFP与.......
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讨论
该FRET实验方案简单且易于重复，所需耗材投入少，并可利用许多现代实验室中的常规设备。具体而言，本实验流程的通用性主要体现在以下五个关键技术特点上。首先，FRET载体通过位点特异性重组技术构建，这种克隆方法操作简便，结果准确，且相比传统的限制性内切酶克隆法更节省时间。其次，N. benthamiana 植物易于培养，可产生相对大量的组织材料，且在大多数实验室中均可获得。第三，农杆菌渗入法（agroinfiltration）可实现所递送载体的瞬时表达，因此可在较短时间内（即24–36小时）获得实验结果，相比之下，转基因植株的生成则需数月时间。第四，通过共渗入不同组合的待测载体，可灵活检测任意两种蛋白质之间的相互作用。最后，只需开启或关闭某一激光通道设置，即可在同一组织样本上依次进行供体荧光寿命FRET（SE-FRET）和受体光漂白FRET（AB-FRET）检测。然而需要注意的是，微粒轰击递送法42可作为将载体导入植物组织的替代方法，以取代农杆菌渗入法；在此情况下，无需使用农杆菌渗入所必需的双元载体。
该方案的一个关键步.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
V.C. 实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（R35GM144059 和 R01GM50224）、美国国家科学基金会（NSF）（MCB191365 和 IOS1758046）以及美以双边农业研究与发展基金（BARD）（IS-5276-20）向 V.C. 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酰丁香酮（3′,5′-二甲氧基-4′-羟基苯乙酮） | Sigma-Aldrich | #D134406-1G | |
| 细菌用琼脂（Bacto Agar） | BD Biosciences | #214010 | |
| 细菌用胰蛋白胨（Bacto trypton） | BD Biosciences | #211705 | |
| 细菌用酵母提取物（Bacto yeast extract） | BD Biosciences | #212750 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） | Zeiss | LSM900 | 任何具有类似功能的共聚焦激光扫描显微镜均可使用 |
| EHA105 | VWR | 104013-310 | 我们使用 Citovsky 细菌实验室库存中的菌株 |
| Gateway BP Clonase II | Invitrogen | #11789100 | |
| Gateway LR Clonase II | Invitrogen | #11791020 | |
| GV3101 | VWR | 104013-296 | 我们使用 Citovsky 细菌实验室库存中的菌株 |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| MES | Sigma-Aldrich | #69889-10G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | #63068-250G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | #S5886-500G | |
| Nicotiana benthamiana 种子 | Herbalistics Pty | RA4 或 LAB | 我们使用 Citovsky 种子实验室库存中的种子 |
| pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
| pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 | N/A | 参考文献 15, 28 | |
| pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 | N/A | 基于 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 载体构建（见参考文献 15, 28） | |
| pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 | N/A | 基于 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 载体构建 | |
| 利福平（Rifampicin） | Sigma-Aldrich | #R7382-5G | |
| 壮观霉素（Spectinomycin） | Sigma-Aldrich | #S4014-5G | |
| 无针注射器 | BD | 309659 | |
| 用于 CLSM 成像的 Zen 软件 | Zeiss | ZEN 3.0 版本 | 软件应与所使用的 CLSM 兼容 |
参考文献
- March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274(2018).
- Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes a....
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重印与许可
