La necessità di nuovi approcci per studiare i siti di contatto di membrana (MCS) è cresciuta a causa del crescente interesse per lo studio di queste strutture cellulari e dei loro componenti. Qui, presentiamo un protocollo che integra tecnologie di microscopia precedentemente disponibili per identificare e quantificare i complessi proteici intra-organello e inter-organello che risiedono nelle MCS.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Visualizzazione e quantificazione delle interazioni proteiche endogene intra-organelli nei siti di contatto ER-mitocondri mediante saggi di legatura di prossimità
In questo articolo
Sommario
Abstract
I siti di contatto con la membrana (MCS) sono aree di stretta vicinanza della membrana che consentono e regolano lo scambio dinamico di diverse biomolecole (ad esempio, calcio e lipidi) tra gli organelli giustapposti senza coinvolgere la fusione della membrana. Le MCS sono essenziali per l'omeostasi cellulare e le loro funzioni sono assicurate dai componenti residenti, che spesso esistono come complessi proteici multimerici. Le MCS spesso coinvolgono il reticolo endoplasmatico (ER), un importante sito di sintesi lipidica e di accumulo cellulare di calcio, e sono particolarmente importanti per gli organelli, come i mitocondri, che sono esclusi dalle classiche vie di trasporto vescicolare. Negli ultimi anni, le MCS tra l'ER e i mitocondri sono state ampiamente studiate, poiché le loro funzioni hanno un forte impatto sul metabolismo cellulare/bioenergetica. Diverse proteine hanno iniziato a essere identificate in questi siti di contatto, tra cui i legami di membrana, i canali del calcio e le proteine di trasferimento lipidico, sollevando così la necessità di nuove metodologie e approcci tecnici per studiare questi componenti MCS. Qui, descriviamo un protocollo costituito da approcci tecnici combinati, che includono il saggio di legatura di prossimità (PLA), la colorazione dei mitocondri e la segmentazione dell'imaging 3D, che consente il rilevamento di proteine che sono fisicamente vicine (>40 nm) tra loro e che risiedono sulla stessa membrana a MCS dei mitocondri ER. Ad esempio, abbiamo utilizzato due proteine di trasferimento lipidico ancorate al reticolo endoplasmatico, ORP5 e ORP8, che hanno precedentemente dimostrato di interagire e localizzarsi nei mitocondri del reticolo endoplasmatico e negli MCS della membrana plasmatica del reticolo endoplasmatico. Associando il PLA ORP5-ORP8 con l'analisi del software di imaging cellulare, è stato possibile stimare la distanza del complesso ORP5-ORP8 dalla superficie mitocondriale e determinare che circa il 50% dell'interazione PLA ORP5-ORP8 si verifica nei sottodomini ER in prossimità dei mitocondri.
Introduzione
La comunicazione tra gli organelli è una caratteristica distintiva delle cellule eucariotiche. Un modo in cui gli organelli comunicano è la formazione di siti di contatto di membrana (MCS), che sono strette opposizioni di membrana tra due organelli che sono mantenute da proteine strutturali e funzionali, come i legami, le proteine di trasferimento lipidico e i canali del calcio1. Le MCS possono essere stabilite tra organelli simili o diversi e mediano lo scambio di componenti cellulari, che è importante per mantenere l'omeostasi cellulare. Ad oggi, sono stati identificati diversi MCS, tra cui il reticolo endoplasmatico (ER)-mitocondri, i contat....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Colorazione mitocondriale e saggio di legatura di prossimità (PLA)
- Piastra 0,5 x 10 5-2 x 10 5 cellule HeLa, mantenute in terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di aminoacidi non essenziali a 37 °C con il 5% di CO2 , in vetrini coprioggetti da 13 mm in piastre da1,5 in 24 pozzetti a una diluizione che consente la confluenza cellulare del 75%-90% il giorno della procedura.
NOTA: Da notare che le cellule HeLa possono essere sottoposte a trattamenti aggiuntivi, come il trattamento con siRNA e/o la trasfezione plasmidica del DNA, pri....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo rilevato i siti di interazione di due proteine di trasferimento lipidico ancorate al reticolo endoplasmatico, ORP5 e ORP8, e valutato la loro presenza nei sottodomini di membrana del reticolo endoplasmatico a contatto con altri organelli, in particolare con i mitocondri. Per questo, la rete mitocondriale nelle cellule HeLa è stata colorata con un marcatore mitocondriale rosso e le macchie verdi del PLA ORP5-ORP8 sono state rilevate dopo la fissazione utilizzando gli anti.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo è stato progettato per identificare e quantificare le interazioni tra le proteine organelle del PLA a livello di MCS, in particolare a livello di MERCS. La novità del protocollo è che combina il PLA con la marcatura di organelli multipli, la microscopia confocale e l'analisi di immagini 3D per localizzare e quantificare le interazioni del PLA tra due proteine che risiedono nella stessa membrana, in questo caso all'interno della membrana ER in stretta prossimità con la membrana dei mitocondri (MAM) o con.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), dal Programma ATIP-Avenir, dalla Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) e dalla Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1X Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Cloruro di ammonio (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Vetrini coprioggetti circolari in vetro 13mm n. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos rosso MitoTracker | Invitrogen | M7512 | marcatore mitocondriale rosso Microscopio |
| confocale invertito SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar Piastre a 24 pozzetti trattate con TC | Merck | CLS3526 | |
| Duolink Reagenti per la rilevazione in situ Verde | in situ Sigma | DUO92002 | |
| Duolink con DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Sonda Anti-Topo MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink Sonda PLA in situ Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink Tamponi di lavaggio in situ, fluorescenza | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Siero Ridotto Medium, Integratore GlutaMAX | Terreno privo di siero | Gibco | 51985026 |
| Software Imaris v 9.3 | Bitplane | N/A | Software di imaging cellulare |
| Incubatore UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Vetrino per microscopio StarFrost (3" x 1") | Mouse in vetro | ||
| anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma | P6148 | |
| coniglio anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponina | Sigma | 84510 | |
| Acqua Distillata Ultra Pura, senza DNasi/RNasi | Invitrogen | 10977-035 |
Riferimenti
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287(2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Bi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
