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方法文章

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

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DOI：

10.3791/64826

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2023年2月10日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

本文内容

摘要

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。

摘要

Ca2+成像可作为细胞活动的间接指标，包括动作电位以及涉及Ca2+进入细胞质或细胞内Ca2+储存库释放的各种信号机制。基于Pirt-GCaMP3的小鼠背根神经节（DRG）初级感觉神经元Ca2+成像具有同时测量大量细胞的优势。最多可监测1,800个神经元，从而能够在正常生理环境下以群体水平在体（in vivo）整体研究神经元网络和躯体感觉过程。所监测的大量神经元使得能够检测到使用其他方法难以发现的活动模式。可通过刺激小鼠后足，直接研究刺激对DRG神经元群体的影响。产生Ca2+瞬变的神经元数量以及Ca2+瞬变的幅度反映了对特定感觉模态的敏感性。神经元的直径可提供被激活纤维类型的信息（无害机械性刺激纤维 vs. 有害性疼痛纤维，Aβ、Aδ和C纤维）。表达特定受体的神经元可通过td-Tomato和特异性Cre重组酶与Pirt-GCaMP联合进行遗传标记。因此，DRG的Pirt-GCaMP3 Ca2+成像为在群体水平上以整体方式分析特定感觉模态和神经元亚型提供了强有力的工具和模型，可用于研究疼痛、瘙痒、触觉及其他躯体感觉信号。

引言

初级感觉神经元直接支配皮肤，并将躯体感觉信息传回中枢神经系统1,2。背根神经节（DRG）是包含10,000至15,000个初级感觉神经元胞体的细胞簇3,4。DRG神经元在大小、髓鞘化程度以及基因和受体表达模式方面表现出多样性。直径较小的神经元包括感知疼痛的神经元，而直径较大的神经元通常对非伤害性机械刺激产生反应5,6。初级感觉神经元的病变，如损伤、慢性炎症和周围神经病变，可使这些神经元对各种刺激变得敏感，从而导致慢性疼痛、异常性疼痛和痛觉过敏7,8。因此，研究DRG神经元对于理解躯体感觉机制以及多种疼痛和瘙痒相关疾病具有重要意义。

神经元放电 体内 对于躯体感觉至关重要，但直到最近，仍缺乏用于研究完整神经节的工具 体内 仅限于相对少量的细胞9在此，我们介绍一种在群体水平上研究神经元动作电位或神经元活动的强大方法 体内 作为一个整体。该方法采用基于细胞质Ca2+ 动力学。Ca2+ 敏感的荧光指示剂可作为测量细胞活性的良好替代方法，因为细胞质中钙离子的浓度通常较低2+这些指标使得在小鼠中能够同时监测数百至数千个初级感觉神经元9,10,11,12,13,14,15,16 和大鼠17方法 体内 钙2+ 本研究中描述的成像技术可用于直接观察群体水平对机械、冷、热和化学刺激的反应。

磷脂酰肌醇结合膜蛋白 Pirt 在几乎所有组织中均高水平表达>95% 的初级感觉神经元18,19 并可用于驱动Ca的表达2+ 传感器，GCaMP3，用于监测神经元活动 体内20在本方案中，描述了用于执行的技巧 体内 背根神经节手术，Ca2+ 成像及分析Pirt-GCaMP3小鼠右侧腰段5（L5）背根神经节14 使用共聚焦激光扫描显微镜（LSM）。

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方案

本文所述所有操作均依照圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会批准的方案进行。

注意：动物手术（步骤1）和成像（步骤2）一旦开始，必须连续完成。数据分析（步骤3）可稍后进行。

1. 手术及固定动物以进行右侧L5背根神经节成像

注意：本研究使用了8周龄或以上的Pirt-GCaMP3 C57BL/6J小鼠，无论雄性或雌性。尽管两种性别的小鼠均可获得同样良好的成像效果，但由于较年轻小鼠的Pirt表达较弱或呈间歇性，因此小鼠年龄应至少为8周。Pirt-GCaMP3 C57BL/6J小鼠由约翰斯·霍普金斯大学研制14。可对任一侧背根神经节（DRG）进行成像，其他腰段DRG（例如腰4节段）也可用于成像。所给出的时间为经验丰富的外科操作者所需时间的估计值。偶尔出现的技术问题（如出血增加）可能会延长操作所需时间。

  1. 配制含有40 mg/mL氯胺酮和6 mg/mL赛拉嗪的无菌生理盐水溶液。总体积应至少为 9 µL/g 手术和成像后安乐死时的体重。
    警告：氯胺酮若被注射、吞食或接触眼睛，可能造成伤害。请小心操作。
  2. 确保所有外科手术器械均已 通过高压灭菌或其他经《美国国立卫生研究院实验动物照护与使用指南》批准的方法进行清洁和灭菌。
  3. 手术前15至25分钟，向Pirt-GCaMP3小鼠腹腔内（i.p.）注射约2.25 µL 每克体重使用酮胺/赛拉嗪（90 mg/kg 酮胺，13.5 mg/kg 赛拉嗪）。酮胺剂量不得超过 120 mg/kg。
  4. 在注射麻醉剂后15至25分钟内（步骤1.3），通过夹捏对侧后肢足垫（非同侧/右侧后肢足垫）检查小鼠是否已达到手术麻醉深度。若后肢无退缩反射，则表明已达到手术麻醉平面。
    注意：在整个实验过程中，使用后肢缩足反射来监测麻醉状态。始终使用对侧后爪。
  5. 将小鼠置于加热垫上，以维持其体温在 37 °C.
    注意：使用立体定位仪固定小鼠头部可能有助于操作（参见 材料表），或其他根据研究者偏好的框架。
  6. 通过触诊小鼠的骨盆骨定位腰膨大区域。剃除小鼠腰膨大区域上方背部的毛发。此步骤应耗时约90秒。
    注意：小鼠可短暂移离加热垫以进行剃毛。
  7. 使用剪刀在腰膨大上方做一个三边矩形切口（8 mm × 20 mm），并用镊子将皮肤掀开图1A此步骤耗时约 2 分钟。
    注意：研究人员也可使用止血钳或牵开器来保持切口开放。该手术为非存活性手术，因此无需对术区进行额外清洁；但可使用聚维酮碘进行清洁。此处给出的是可接受的最大切口尺寸。较小的切口优于较大的切口。
  8. 使用13 mm弹簧解剖剪在脊柱右侧做3-4 mm的切口。用剪刀将皮肤和肌肉向两侧剪开，以暴露脊柱。图1B此步骤耗时约 3 分钟。
  9. 使用8 mm剪刀剪除肌肉和结缔组织，清理右侧L5背根神经节的横突，操作时尽量减少出血。使用棉片和/或明胶海绵吸收血液。L5椎骨位于骨盆骨前方，是骨盆前方的第一个椎骨。
    注意：此步骤大约需要 3 分钟，如果动物出血量超过正常水平，可能需要额外时间。
  10. 使用弗里德曼-皮尔逊咬骨钳或坚固的精细镊子切开右侧L5横突。注意不要触碰背根神经节（DRG）图1C).
    注意：此步骤约需 2 分钟，但如果动物出血量超过正常水平，可能需要额外时间。
  11. 在出血完全停止之前不要继续操作。使用明胶海绵或棉片防止血液流至DRG表面。此步骤需要1-4分钟。
  12. 将小鼠和加热垫移至定制平台（图2A，B）。使用固定胶带将动物和加热垫固定。将动物的鼻子放入鼻罩中，以持续给予异氟烷麻醉。固定动物右侧后肢足垫，使其伸出固定板外，以便于对足垫施加刺激。此步骤耗时3分钟。
  13. 用脊柱夹钳在L5背根神经节（DRG）前后方的椎骨和/或骨盆骨上方的皮肤处将脊柱固定。调整夹钳和载物台，使DRG表面尽可能水平图2B，C).
    注意：可能需要修剪位于背根神经节与物镜之间的组织。
  14. 将载物台置于显微镜下方，使物镜下降时位于DRG正上方8 mm处（图3A，B插入直肠温度计。
    注意：DRG 与物镜之间的距离可能因物镜、显微镜和实验动物的不同而有所变化。
  15. 将电源线连接至加热垫和直肠温度计。将鼻罩连接至异氟烷气体管路。

figure-protocol-1
图1：背根神经节暴露手术示例。（A） 局部区域剃毛后切开皮肤并将其翻起，切口沿头尾轴方向长约10 mm。（B）在脊柱右侧做切口，剪除肌肉和结缔组织，暴露右侧L5横突，使用明胶海绵吸除血液。（C）清理横突并去除覆盖背根神经节的骨组织。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-protocol-2
图 2：将小鼠固定在定制平台上进行背根神经节成像。（A）展示定制平台。该平台由基板和用于固定动物的平板组成。动物固定板连接在一个可锁定的球窝旋转接头上。一个带有输送氧气/异氟烷混合气体管路的鼻罩、废气排放管以及一个用铝箔包裹的加热垫，均用胶带固定在动物固定板上。两个臂状结构各由三个可锁定的球窝旋转接头构成，并用螺栓固定在基板上。每个臂状结构末端装有一个由镊子改制而成的夹具，带有螺丝用于调节松紧。（B）小鼠被固定在动物固定板上，鼻部插入鼻罩中。夹具夹住皮肤以固定脊柱和骨盆骨。右侧（同侧）后爪用胶带固定并伸出，便于施加刺激。（C）夹住的脊柱和骨盆骨的特写图像。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-protocol-3
图3：动物被放置在定制平台上，位于显微镜物镜下方。（A）平台、动物和显微镜的广角视图。左侧可见连接至直流温度控制器的电线，以及通往氧气/异氟烷吸入和废气管路的管道。（B）显微镜物镜下动物的特写视图。背根神经节（DRG）位于物镜下方约 8 mm 处。直肠温度计已插入，动物鼻部位于鼻罩内。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 背根神经节成像

  1. 使用直立共聚焦显微镜10x/0.4 DIC物镜及配套软件（参见 材料表用于成像。使用绿色滤光片（FITC）设置：激发波长 495 nm，发射波长 519 nm，检测波长范围 500–580 nm，成像装置为 GaAsP-Pmt1，检测器为 GaAsP-PMT。
    注意：对于其他显微镜，请使用制造商推荐的设置。
  2. 在显微镜下找到背根神经节（DRG）的表面。调节载物台上的夹具，使DRG表面尽可能水平，并使最大表面积位于焦平面上。
    注意：物镜的选择可能因所使用的显微镜型号及用户偏好而异。软件的选择取决于显微镜的类型。使用高动态范围（DRG）可获得更清晰的图像，有助于软件生成更清晰的视频，支持对更多神经元进行成像，并使数据分析更简便且更准确。
  3. 通过鼻罩向小鼠供应1%-1.5%异氟烷的氧气气流，以确保其保持麻醉状态。在整个操作过程中密切监测动物，维持异氟烷麻醉深度，避免过量。
    注意：维持麻醉所需的异氟烷用量可能因个体动物和刺激因素而异。通常1.5%的浓度已足够。若动物在刺激过程中出现移动，应增加异氟烷浓度；若呼吸变浅，应降低异氟烷浓度。 每次刺激前，检测对侧后肢足底的缩足反射。
    警告：吸入异氟烷可能有害，或引起头晕、嗜睡。避免吸入，仅可在通风良好的区域使用。
  4. 加载显微镜快速扫描程序。
    1. 使用快速扫描的常规设置：体素尺寸 2.496 µm x 2.496 µm x 16 µm，512 x 512 像素，10 层光学切片 Z 轴堆叠，1 艾里单位（AU）/32 µm，1% 488 nm 激光功率 5 mW，像素时间 1.52 µs，行扫描时间为 0.91 ms，帧扫描时间为 465 ms，共聚焦扫描速度为 8，双向扫描，GaAsP-PMT 检测器增益为 650 V，数字增益为 1。最佳设置可能因显微镜和实验动物的不同而有所差异。
    2. 要设置快速扫描程序，请点击 采集 选项卡。在下方 采集参数，点击 帧 标签。单击 预设 > 512 x 512 将显微镜设置为记录一幅512像素 × 512像素的图像。这将根据由显微镜软件确定的图像尺寸，相应地设定体素大小的X和Y值。
    3. 下 采集参数，点击 通道 标签。单击 Track2 盒子。使用 Track2 盒子旁边的下拉菜单进行选择 绿色 (FITC)。下方将打开一个新标签页，位于 Track2 下方。
    4. 旁边 激光器，点击 488 盒子。这将设定激发和发射波长。
    5. 在488 nm滑块旁边，设置 激光功率 至1%。点击 1 AU 按钮以设置1 Airy单位的孔径。在FITC下，设置 主增益 至 650 V， 数码胶印 至 0，和 数字增益 至 1.
    6. 在……之下 采集 标签，检查 Z轴扫描 盒。单击 活体 点击按钮以查看神经节的实时图像。向上调节焦平面旋钮，直至仅有一小段弧形的神经元可见。
    7. 下方 采集参数，点击 Z轴层扫 标签 > 设置为最后 按钮。向下调节焦平面旋钮，直至仅有一小段弧形的神经元可见。在 采集参数，点击 Z轴层扫 标签 > 设置初始值 按钮。单击 活体 关闭实时图像的按钮。
    8. 下 采集参数，点击 Z轴层扫 表格。填写 切片 设置10个光学切片，并自动确定体素深度。
    9. 在“采集”选项卡下，单击 时间序列 盒。在采集参数下将出现一个新的时间序列选项卡。单击该选项卡 时间序列 标签 > 循环 输入您希望进行的循环次数，此处为8。
    10. 设置扫描速度和方向。在 采集参数，采集模式 标签 > > 方向 > 双向箭头 用于双向扫描。选择 采集模式选项卡 > 帧 > 扫描速度滑块 > 8.
      注意：通常可以加载先前实验的设置，仅需根据图像过亮或过暗调整激光功率，并调整Z轴层扫的“设置末层”和“设置首层”。
  5. 通过点击对DRG进行一个短暂的8个循环扫描 开始实验 在……之下 采集 制作电影：通过随时间对扫描图像（每帧一幅扫描图像）进行正交投影来创建，并手动检查图像清晰度以及成像伪影，例如 "波浪" 调整钳位位置和光学切片厚度，并重复此步骤，直至获得清晰、高质量的视频。
    注意：如果动物发生移动或被研究人员移动，应重复此步骤。需注意的问题包括神经节区域（而不仅是单个神经元）在实验过程中出现明暗交替变化，产生波纹状外观，或导致某些区域消失或变得更亮。若移动幅度超过一个小神经元直径的一半（<20 µm波纹状伪影是另一个主要问题。通常可以通过缩短Z轴层叠扫描的起始与终止位置之间的距离（见上述步骤2.4.4）并减小光学切片厚度来解决。 视频 1 在调整和设定正确的光学切片厚度之前，呈现一个波浪状神经节的示例。 视频 2 校正调平和光学切片厚度后，差异虽细微，但对分析结果有巨大影响。
  6. 加载显微镜高分辨率扫描程序。
    1. 使用高分辨率扫描的常规设置：体素大小 1.248 µm x 1.248 µm x 14 µm，1024 x 1024 像素，6 层光学切片 Z 轴堆叠，1.2 艾里单位（AU）/39 µm，5% 488 nm 激光功率/25 mW，像素时间 2.06 µs，行扫描时间为 4.95 ms，帧扫描时间为 5.06 s，共聚焦扫描速度为 6，双向扫描，GaAsP-PMT 检测器增益为 650 V，数字增益为 1。最佳设置可能因显微镜和实验动物的不同而有所差异。
    2. 要设置高分辨率扫描程序，请点击 采集 标签。在下方 采集参数，点击 帧 标签。单击 预设 > 1024 x 1024 将显微镜设置为记录一幅1024像素 × 1024像素的图像。这将根据由显微镜软件确定的图像尺寸，相应地设定体素大小的X和Y值。
    3. 下方 采集参数，点击 通道 标签。单击 Track2 盒子。使用 Track2 盒子旁边的下拉菜单进行选择 绿色 (FITC)。下方将打开一个新标签页 Track2。
    4. 在激光器旁边，点击 488 盒子。这将设定激发和发射波长。点击 高强度激光测距 盒子
    5. 在488 nm滑块旁边设置 激光功率 至 5%。单击 1 AU 按钮以设置1艾里单位的孔径。在FITC下设置 主增益 至 650 V， 数码胶印 至 0，且 数字增益 至 1.
    6. 在……之下 采集 标签，检查 Z轴扫描 盒。单击 活体 点击按钮以查看神经节的实时图像。向上调节焦平面旋钮，直至仅有一小段弧形的神经元可见。
    7. 在……下方 采集参数，点击 Z轴层扫 标签 > 设置最后 按钮。向下调节焦平面旋钮，直至仅能看到一小段弧形的神经元。在 采集参数，点击 Z轴层扫 标签 > 设置初始值 按钮。单击 活体 关闭实时图像的按钮。
    8. 在……下方 采集参数，点击 Z轴扫描 表格。填写 切片 设置6个光学切片，并自动确定体素深度。
    9. 在……之下 采集 标签，确保 时间序列 复选框未勾选（无时间序列）。
    10. 设置扫描速度和方向。在 采集参数，点击 采集模式 标签 > 框架 > 预设 > 1024 x 1024. 选择 采集模式 标签 > 框架 > 方向 > 双头箭头 用于双向扫描。选择 采集模式 标签 > 框架 > 扫描速度滑块 > 6.
    11. 如果细胞标记了 td-Tomato，则将显微镜设置为扫描红色通道，激发波长 592 nm/发射波长 614 nm，检测波长范围 600–700 nm，同时设置绿色通道。通过以下步骤进行设置： 采集参数 并点击 通道 标签 > Track1 盒子。使用 Track1 盒子旁边的下拉菜单进行选择 红色 （Texas Red）。除点击相应的选项外，其余步骤与2.6.3相同。 561 盒而不是 488 盒。设置 激光功率 至1%。Td-Tomato比GCaMP3更亮，所需激光功率更低。
  7. 通过点击来获取背根神经节的高分辨率图像 开始实验 按钮位于下方 采集 表。
  8. 加载显微镜快速扫描程序（参见步骤 2.4）。记录背根神经节（DRG）的自发活动 80 个周期（约 10 分钟）。生成正交投影视频，并确认图像质量足以用于分析。
    注意：质量要求与步骤 2.5 相同。
  9. 为施加刺激，将显微镜设置为执行15-20次扫描。等待前5次扫描完成以建立基线。在第6至第10次扫描期间施加刺激。每次刺激后至少等待5分钟再施加下一次刺激，以防止脱敏。
    注意：应先施加机械刺激，然后依次施加冷刺激、热刺激和化学刺激。较弱的刺激（例如低机械力、接近室温的温度）应在较强刺激（例如较高机械力、远离室温的温度）之前施加。施加刺激时，务必避免引起背根神经节（DRG）的任何移动。特别是对于强热刺激，通常需要在开始刺激前应用2%异氟烷1–2分钟。在本研究使用的显微镜上，每次扫描均可清晰听到，研究人员可据此轻松识别扫描结束时间，从而在第5次扫描结束后立即施加刺激。然而，任何能够确保在一致时间点施加刺激的方法均可使用。
  10. 对于机械压力，使用镇痛仪的夹钳夹住足爪，将足爪置于两个桨片之间，但不要触碰足爪，并在扫描5结束后的立即开始夹捏，扫描10结束后的立即停止。使用镇痛仪监测加压力量（参见 材料表）。尽量使按压力量接近目标力量（此处使用100 g的按压刺激），并确保不超过目标力量10 g。
    注意：可使用低至 0.07 g 的 von Frey 纤维丝和高至 600 g 压力的测力装置检测刺激。
  11. 对于冷刺激和热刺激，将烧杯中的水冷却或加热至略低于（冷刺激）或略高于（热刺激）目标温度，然后开始扫描。此处使用一个 45 °C 刺激。当水温适宜时，在第5次扫描后立即将足爪浸入水中以施加刺激。在第10次扫描后立即移开烧杯。
    注意：温度应在 1 °C 所需温度的第5次扫描。如果烧杯温度不正确，请勿施加刺激，因为这可能导致神经元脱敏。相反，应重新冷却或加热水，然后再次尝试。我们已测量到低至 0 °C （冰水）以及高达 95 °C然而，请记住，高于 50 °C 可能损伤组织并干扰后续实验。类似地，某些化学物质（例如河豚毒素、辣椒素）具有不可逆作用或无法通过冲洗去除，可能妨碍在动物上进行进一步的实验。
  12. 在完成所有刺激的施加和记录后，通过过量注射氯胺酮/赛拉嗪（200 mg/kg 氯胺酮，30 mg/kg 赛拉嗪）实施安乐死，或 5 µL 每克体重注射步骤1.1中配制的溶液，随后断头处死。

3. 数据分析

  1. 通过将图像文件拖放到 ImageJ 中来打开。打开文件后，在 图像 > 类型 > RGB 颜色 下选择图像类型。
    注意：插件 > StackReg 下的 StackReg21 插件可用于校正和对齐运动伪影。ImageJ 可读取大多数显微镜软件的文件格式。图像类型的选取取决于用户偏好。RGB 模式便于生成用于发表的彩色图像。显微镜制造商提供的软件包或 cytoNet22 也可辅助分析。下载、安装和使用 StackReg 并非必需，但建议使用。
  2. 使用“感兴趣区域（ROI）”工具，在 分析 > 工具 > ROI 管理器 下选择活跃神经元。使用工具栏中的 椭圆 或 矩形 工具绘制 ROI，并通过点击 ROI 管理器窗口中“添加”下方的 添加 按钮，或按下键盘上的“t”键，将 ROI 添加至 ROI 文件中。
    注意：请务必频繁保存 ROI 文件。用户可通过将 ROI 文件拖放到 ImageJ 中，并点击 ROI 管理器窗口底部的 显示全部 复选框，随时恢复 ROI。不建议以叠加形式保存。根据经验，以 ROI.zip 文件格式保存可简化后续分析。
  3. 在 分析 > 设置测量值 中，确保勾选 平均灰度值 选项；取消勾选“设置测量值”下的所有其他选项。使用 ROI 管理器菜单中的多测量工具计算 ROI 内的荧光强度。在 ROI 窗口中，通过 更多 > 多次测量 进行强度测量。
    注意：有时相邻神经元距离过近，无法分别绘制独立的 ROI。此类神经元不能用于瞬时强度测量，但可纳入激活神经元的计数中。
  4. 保存由“多次测量”功能生成的 CSV 文件，并使用任意电子表格软件打开该 CSV 文件。
    注意：参见 补充文件 1 中提供的电子表格模板示例，以辅助数据分析。
  5. 将 Ca2+ 瞬变强度计算为 ΔF / F0 = (Ft - F0) / F0，其中 Ft 表示在感兴趣时间点 ROI 内的像素强度，F0 表示基线强度，通过取 Ca2+ 瞬变前 2–4 帧（自发活动）或 ROI 前 1–5 帧（刺激期间发生的 Ca2+ 瞬变）的平均强度确定。排除在刺激前即出现 Ca2+ 峰值的神经元，且不分析刺激结束后出现的活动。
  6. 进行 Ca2+ 瞬变强度分析时，应从每个神经节中随机抽取数量大致相等的神经元，以避免数据偏向于响应神经元数量较多的神经节。排除 ΔF / F0 < 0.15 的峰值。
    注意：已有多种已发表的神经元分析及纳入/排除标准方法11,12,23,24,25,26,27,28。
  7. 使用 ImageJ 工具栏中的 直线 工具测量神经元直径。根据沿最长和最短直径绘制的直线，计算平均直径。

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结果

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图4Pirt-GCaMP3 小鼠 L5 背根神经节的代表性图像 (A,D) 显示了 Pirt-GCaMP3 小鼠 L5 背根神经节的单帧高分辨率扫描图像。 (B，E). 无刺激条件下，分别来自图A和图D的Pirt-GCaMP3 L5背根神经节15帧图像的平均强度投影。部分神经元表现出自发性Ca2+ 瞬变信号用黄色箭头标出。C) Pirt-GCaMP3视网膜神经节细胞在100 g后爪按压刺激期间，刺激前两帧及刺激过程中全部五帧的平均强度投影（来自A图）。某些神经元在刺激期间产生了Ca2+ 刺激期间的瞬时反应用黄色箭头标出...

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讨论

持续性疼痛存在于多种疾病中，影响约8%的人群，导致功能丧失和/或生活质量下降29。初级感觉神经元可检测皮肤上的有害刺激，其可塑性参与了持续性疼痛的发生8。虽然神经元可以在细胞培养和组织外植体中进行研究，但这些方法使其脱离了正常的生理环境。通过手术暴露背根神经节（DRG），结合Pirt-GCaMP3的Ca2+成像技术，可在对后爪施加刺激的情况下，在正常生理环境中研究初级感觉神经元。该Ca2+成像方法的主要优势在于能够同时监测大量神经元。该方法可在群体水平上分析感觉模式、神经元直径以及偶联激活等罕见现象10,11,12,13,14,

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R01DE026677 和 R01DE031477（授予 Y.S.K.），UTHSCSA 启动资金（Y.S.K.），德克萨斯大学系统的 Rising STAR 奖（Y.S.K.），以及 Craniofacial Oral-biology Student Training in Academic Research（COSTAR）美国国立卫生研究院资助编号 5T32DE014318（授予 J.S.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿法沙龙注射液（赛拉嗪）Covetrus, Akorn33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC卡尔蔡司422642-9900-000
棉签麦克森24-106-1S
弯止血钳精细科学工具13007-12
直流温度控制器FHC40-90-8D
直流温度控制器加热垫FHC40-90-2-05
杜蒙陶瓷涂层镊子精细科学工具11252-50
FHC 直流温度控制器FHC40-90-8D
氟瑞索（异氟烷）MWI 动物健康，皮拉美尔集团501017
弗里德曼-皮尔逊咬骨钳精细科学工具16221-14
明胶海绵（GelFoam）辉瑞09-0353-01
凯他捷（氯胺酮）硕腾KET-00002R2
发光绿色载物台胶带JSITON/亚马逊B803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 异氟烷蒸发器Midmark91305430
显微解剖剪刀罗博兹RS-5882
显微解剖弹簧剪刀精细科学工具15023-10
显微解剖弹簧剪刀罗博兹RS-5677
迷你直肠热敏电阻探头FHC40-90-5D-02
手术剪刀罗博兹RS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J 小鼠约翰斯·霍普金斯大学N/A两种性别的小鼠均可同等良好地进行成像。由于较年轻小鼠中 Pirt 启动子表达较弱或间歇性，因此小鼠年龄应至少为 8 周。
SMALGO 小动物痛觉测量仪Bioseb 体内研究仪器公司BIO-SMALGO
立体定位仪Kopf 型号 923-B923-B
td-Tomato C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室7909
顶板，6 英寸 × 10 英寸纽波特290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室17769
蔡司 LSM 800 共聚焦显微镜卡尔蔡司LSM800
蔡司 Zen 2.6 蓝色版软件卡尔蔡司Zen (Blue Edition) 2.6

参考文献

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