يقدم هذا البروتوكول مقايسات السمية الخلوية شائعة الاستخدام (مقايسات Alamar Blue [AB] ، CFDA-AM ، الأحمر المحايد ، و MTT) التي تم تكييفها لتقييم السمية الخلوية في جنين الزرد (ZEM2S) وخطوط خلايا الكبد (ZFL) في 96 لوحة بئر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أصبحت خطوط خلايا الأسماك تستخدم بشكل متزايد في دراسات السمية البيئية ، وتم اقتراح مقايسات السمية الخلوية كطرق للتنبؤ بالسمية الحادة للأسماك. وبالتالي ، يقدم هذا البروتوكول مقايسات السمية الخلوية المعدلة لتقييم صلاحية الخلية في جنين الزرد (Danio rerio) (ZEM2S) وخطوط خلايا الكبد (ZFL) في 96 لوحة بئر. نقاط نهاية السمية الخلوية التي تم تقييمها هي سلامة الميتوكوندريا (مقايسات Alamar Blue [AB] و MTT) ، وسلامة الغشاء عبر نشاط الإستراز (مقايسة CFDA-AM) ، وسلامة الغشاء الليزوزومي (مقايسة الأحمر المحايد [NR]). بعد التعرض لمواد الاختبار في لوحة 96 بئرا ، يتم إجراء فحوصات السمية الخلوية ؛ هنا ، يتم تنفيذ AB و CFDA-AM في وقت واحد ، متبوعا ب NR على نفس اللوحة ، بينما يتم إجراء اختبار MTT على لوحة منفصلة. يتم أخذ قراءات هذه المقايسات عن طريق مضان AB و CFDA-AM ، وامتصاص MTT و NR. يمكن استخدام مقايسات السمية الخلوية التي يتم إجراؤها باستخدام خطوط خلايا الأسماك هذه لدراسة السمية الحادة للمواد الكيميائية على الأسماك.
المقدمة
يجب اختبار المواد الكيميائية فيما يتعلق بسلامتها لصحة الإنسان والبيئة. تم النظر بشكل متزايد في المؤشرات الحيوية الجزيئية والخلوية في تقييمات السلامة للتنبؤ بالتأثيرات على الكائنات الحية من قبل الوكالات التنظيمية و / أو التشريعات (على سبيل المثال ، REACH ، OECD ، US EPA)1,2 ، لأنها يمكن أن تسبق النتائج الضارة في الجسم الحي (على سبيل المثال ، اضطراب الغدد الصماء ، والاستجابة المناعية ، والسمية الحادة ، والسمية الضوئية)3،4،5،6،7 . في هذا الس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة المواد المستخدمة في هذا البروتوكول والجدول 1 لمعرفة تركيبة المحاليل والوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. تحضير خلايا ZFL و ZEM2S
- ابدأ بقارورة T75 من خلايا ZFL أو ZEM2S مع التقاء 80٪ ، مستزرعة في الوسط الكامل المعني عند 28 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2.
- قم بإزالة وسط الاستزراع من القارورة واغسل الخلايا بإضافة 10 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (0.01 م). أضف 3 مل من 1x تربسين (0.05٪ v / v ؛ 0.5 mM trypsin-EDTA) إلى قوارير الاستزراع. احتضان في 28 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- اضغط برفق على القارورة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 3 لوحات مقايسات AB و CFDA-AM و NR و MTT. بالنسبة لمقايسة AB (الشكل 3A) ، تظهر الآبار والآبار الفارغة التي لا تحتوي على خلايا قابلة للحياة أو عدد أقل منها اللون الأزرق ومضان منخفض ، في حين أن الآبار التي تحتوي على عدد كبير من الخلايا القابلة للحياة تكون وردية اللون وتقدم قيما فلورية عالية بسبب تحول resazurin (AB) إلى resorufin (مادة وردية) بواسطة الخلايا القابلة للحياة. بالنسبة لفحص CFDA-AM ، لا يوجد فرق واضح في لون الآبار على اللوحة ؛ ومع ذلك ، فإن ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تستخدم مقايسات السمية الخلوية على نطاق واسع لتقييم السمية في المختبر ، وتقدم مقالة البروتوكول هذه أربعة مقايسات سمية خلوية شائعة الاستخدام معدلة ليتم إجراؤها في خطوط خلايا الزرد (أي كثافة الخلية للوحة 96 بئرا ، ووقت الحضانة في مقايسة MTT ، واستنفاد FBS أثناء حالة التعرض الكيميائي ، والتركيز الأقصى المقبول ل SC). نظرا لأن هذه المقايسات تحدد السمية الخلوية من خلال نقاط نهاية مختلفة لصلاحية الخلية (وظيفة التمثيل الغذائي ، وسلامة الغشاء الليزوزومي ، وسلامة غشاء الخلية) ، فإن الجمع بينها يوفر تقييما دقيقا للسمية الخل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
في ذكرى الدكتور مارسيو لورينسيني ، مؤلف مشارك في هذا العمل ، باحث ممتاز في مجال مستحضرات التجميل ومكرس لتعزيز أبحاث التجميل في البرازيل. يعرب المؤلفون عن امتنانهم للمختبر متعدد المستخدمين في قسم علم وظائف الأعضاء (UFPR) لتوافر المعدات وللدعم المالي المقدم من التنسيق من أجل تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES ، البرازيل) (قانون المالية 001) و Grupo Boticario.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5-CFDA ، AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate ، Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| لوحة ثقافة الخلايا ، 96 لوحة بئر | Sarstedt | 83.3924 | السطح: قياسي ، قاعدة مسطحة |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | مسحوق ، جلوكوز عالي ، بيروفات |
| FBS - مصل الأبقار الجنيني ، مؤهل ، مناطق معتمدة من وزارة الزراعة | الأمريكية Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix ، مسحوق | Gibco | 21700026 | مسحوق |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | مسحوق |
| أحمر محايد & nbsp ؛ | Sigma-Aldrich | N4638 | ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا |
| شاكر مداري ؛ | Warmest | KLD-350-BI | قطر دوران 22 مم |
| Dulbeccos PBS (10X) مع الكالسيوم والمغنيسيوم | Invitrogen | 14080055 | |
| البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) | Gibco | 15140122 | |
| ملح الصوديوم ريزازورين | مسحوق Sigma-Aldrich | R7017 | ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | مسحوق |
| بيكربونات الصوديوم | مسحوق Sigma-Aldrich | S5761 | ، كاشف حيوي للبيولوجيا الجزيئية |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide ؛ 98٪ | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| صبغة زرقاء Trypan (0.4٪) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5٪) ، لا يوجد فينول أحمر | Gibco | 15400054 | |
| خط خلية ZEM2S | ATCC | CRL-2147 | تم التبرع بهذا الخط الخلوي من قبل البروفيسور الدكتور مايكل ج. كارفان (جامعة ويسكونسن ، ميلووكي ، الولايات المتحدة الأمريكية) |
| خط خلية ZFL | BCRJ | 256 |
المراجع
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from:
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
