Светоиндуцированный диэлектрофорез для характеристики электрического поведения мезенхимальных стволовых клеток человека

Summary

Здесь мы представляем светоиндуцированный диэлектрофорез как безметочный подход к характеристике гетерогенных клеточных линий, в частности мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК). В этой статье описывается протокол использования и оптимизации микрофлюидного устройства с фотопроводящим слоем для характеристики электрического поведения hMSC без изменения их нативного состояния.

Abstract

Мезенхимальные стволовые клетки человека (МСК) являются источником клеток, полученных от пациента, для проведения механистических исследований заболеваний или для нескольких терапевтических применений. Понимание свойств hMSC, таких как их электрическое поведение на различных стадиях созревания, стало более важным в последние годы. Диэлектрофорез (ДЭП) - это метод, который может манипулировать клетками в неоднородном электрическом поле, с помощью которого можно получить информацию об электрических свойствах клеток, таких как емкость клеточной мембраны и диэлектрическая проницаемость. Традиционные режимы ДЭП используют металлические электроды, такие как трехмерные электроды, для характеристики реакции клеток на ДЭП. В этой статье мы представляем микрофлюидное устройство, построенное с фотопроводящим слоем, способным манипулировать клетками через световые проекции, которые действуют как виртуальные электроды in situ с легко согласуемой геометрией. Здесь представлен протокол, демонстрирующий это явление, называемое индуцированным светом DEP (LiDEP), для характеристики hMSCs. Мы показываем, что LiDEP-индуцированные клеточные реакции, измеряемые как скорости клеток, могут быть оптимизированы с помощью различных параметров, таких как входное напряжение, диапазоны длин волн световых проекций и интенсивность источника света. В будущем мы предполагаем, что эта платформа может проложить путь для технологий, которые не содержат меток и выполняют характеристику гетерогенных популяций hMSC или других линий стволовых клеток в режиме реального времени.

Introduction

Мезенхимальные стволовые клетки человека (МСК) известны своими иммуносупрессивными^{свойствами1}, что привело к их использованию в терапии для лечения различных заболеваний, таких как диабет II типа², реакция «трансплантат против хозяина»³ и болезнь печени⁴. HMSC неоднородны, содержат субпопуляции клеток, которые дифференцируются в адипоциты, хондроциты и остеобласты. HMSC получают из жировой ткани, ткани пуповины и костного мозга, и их потенциал дифференцировки зависит от ткани происхождения и используемого процесса культивирования клеток⁵. Например, согласно исследованию Sakaguchi et al., hMSCs, полученные из жировой ткани, с большей вероятностью дифференцируются в адипоциты, тогда как hMSCs, полученные из костного мозга, с большей вероятностью дифференцируются в остеоциты⁶. Тем не менее, влияние тканевого происхождения гМСК на их дифференцировочный потенциал является явлением, которое все еще нуждается в дальнейшем понимании. Кроме того, различные дифференцировочные потенциалы МСК способствуют присущей им гетерогенности и создают проблемы при применении МСК для терапии. Таким образом, характеристика, а также сортировка гетерогенных линий стволовых клеток имеет решающее значение для разработки in vitro и клинического применения этих клеток. Проточная цитометрия, метод золотого стандарта для изучения различий в клеточных фенотипах, использует антигены клеточной поверхности и флуоресцентные красители для маркировки клеток-мишеней и их характеристики на основе светорассеяния или характеристик клеточной флуоресценции ^6,7,8. Недостатки этого метода включают ограниченную доступность биомаркеров антигена клеточной поверхности, высокую стоимость оборудования и эксплуатации, а также тот факт, что окрашивание клеточной поверхности может потенциально повредить клеточную мембрану и повлиять на терапевтическое применение 9,10,11. Таким образом, изучение новых методов характеристики клеток без ущерба для нативного состояния клеточной мембраны может принести пользу клинической эффективности терапии стволовыми клетками.

Диэлектрофорез (DEP), метод характеристики клеток, в котором не используются поверхностные метки, находится в центре внимания этой текущей работы. DEP - это метод без меток или без окрашивания, реализованный на микрофлюидных платформах для характеристики гетерогенных популяций клеток на основе их электрических свойств. DEP использует электрическое поле переменного тока (AC) вместо флуоресцентного окрашивания (т. е. метод на основе меток)⁷. Другие преимущества использования микрофлюидных устройств на основе DEP для характеристики клеток включают использование небольших объемов (микролитров), быстрое время анализа, минимальные требования к подготовке образцов клеток, минимальный риск загрязнения образцов, минимальное производство отходов и низкую стоимость^12,13. Еще одним преимуществом DEP является мониторинг ячеек^14,15,16 в режиме реального времени. Для ДЭП клетки в суспензии подвергаются воздействию неоднородного электрического поля переменного тока, создаваемого электродами, и они становятся поляризованными⁶. Эта поляризация вызывает движение клеток и позволяет манипулировать ячейками в зависимости от частоты и напряжения приложенного переменного электрического поля. Регулируя частоту, обычно от 5 кГц до 20 МГц, клетки могут притягиваться к электродам или отталкиваться от них, что соответствует положительному и отрицательному поведению DEP, соответственно⁶.

Существует несколько режимов определения характеристик DEP, а именно: традиционный, фракционирование полевого потока и индуцированный светом, как классифицируется по конфигурации электродов и/или стратегии^{работы 17}. Анализатор 3DEP, традиционный режим DEP, включает в себя физические металлические электроды и контролирует клеточную реакцию на электрическое поле переменного тока. Эта система использует чип, состоящий из микролунок с несколькими трехмерными круглыми электродами, и обнаруживает изменения интенсивности света для характеристики поведения DEP ячейки 18,19,20,21. Положительный DEP наблюдается, когда клетки движутся к краям круглых электродов вдоль стенок микролунки, что приводит к увеличению интенсивности света в центре микролунки. Отрицательный DEP наблюдается в виде скопления клеток в центре микролунки вдали от круглых электродов, что приводит к снижению интенсивности света в центре микролунки. Эти два явления представлены на рисунке 1. Традиционные методы DEP способны характеризовать электрические свойства гетерогенных клеточных популяций 18,20,21. Например, Mulhall et al. продемонстрировали возможность различать нормальные кератиноциты полости рта (HOK) и злокачественные клеточные линии кератиноцитов полости рта (H357) на основе различий в емкости^{мембраны 21} с использованием анализатора 3DEP. Однако одним из ограничений традиционных режимов DEP является фиксированная геометрия электрода. Поскольку hMSC неоднородны, выгодно иметь возможность легко изменять геометрию электродов во время оценок DEP. Например, возможность модифицировать электроды или электродные решетки в режиме реального времени для захвата одной ячейки позволяет характеризовать ячейки на основе скорости и поведения DEP. Применение модификации электродов в режиме реального времени при оценке DEP hMSCs позволяет проводить одноклеточный анализ hMSCs сразу после получения их из ткани образца, чтобы охарактеризовать гетерогенность популяции образца.

Чтобы преодолеть ограничение традиционных режимов DEP (т.е. фиксированных физических электродов) и изучить новые возможности для модификации конфигурации электродов в реальном времени с использованием явления DEP, был исследован индуцированный светом DEP (LiDEP). LiDEP - это нетрадиционный режим DEP, который манипулирует клетками с помощью фотопроводящего микрофлюидного устройства^22,23 с помощью световых проекций, локализованные электроды создают неоднородное электрическое поле^, аналогичное традиционному методу DEP. Этот подход также обеспечивает гибкость геометрии электродов и перемещение электродов внутри микрофлюидного устройства. Это смягчает ограничения, наблюдаемые с фиксированными электродами, и дает возможность получить больше информации о клеточной гетерогенности. LiDEP использовался для обнаружения и анализа различных типов клеток в гомогенных и гетерогенных популяциях клеток^22,23,24. Например, Liao et al. использовали LiDEP для отделения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), экспрессирующих модуль адгезии эпителиальных клеток (EpCAM^neg), от эритроцитов, чтобы изучить их значение при метастазировании рака²². Одноклеточный анализ с LiDEP успешно используется для характеристики и манипулирования раковыми клетками со стратификацией онкогенности поджелудочной железы²³ и анализа ЦОК в образцах до и после метастазирования²⁴.

Здесь мы описываем, как LiDEP можно использовать для манипулирования hMSC с различными геометриями электродов (круг, ромб, звезда и параллельные линии) и системными настройками (приложенное напряжение, интенсивность света и материал микрофлюидного устройства), тем самым предлагая подход к характеристике поведения стволовых клеток человека с виртуальными электродами.

Protocol

1. Изготовление микрофлюидных устройств LiDEP

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс изготовления состоит из объединения трех слоистых компонентов: (i) фотопроводящего слоя с аморфным кремнием (A:Si) и молибденом, нанесенных на стеклянную подложку из оксида индия и олова (ITO); (ii) микроканальный слой, вырезанный из двустороннего скотча; и (iii) верхняя стеклянная подложка ITO с отверстиями, просверленными для входа и выхода суспензии ячейки.

1. Покрытие стекла фотопроводящим оксидом индия и олова (ITO)
   1. Очистите стеклянную подложку с покрытием ITO (сопротивление 15-20 Ω) путем подачи газообразного азота (N₂) на поверхность со скоростью потока, достаточной для перемещения видимых частиц пыли. После этого шага промойте субстрат ацетоном.
   2. Перенесите предметное стекло с покрытием ITO в ванну с изопропиловым спиртом, чтобы смыть остатки ацетона, промойте водой DI и снова подайте газ N₂ до полного высыхания субстрата.
   3. Поместите предметное стекло стороной с покрытием ITO вверх в систему вакуумного распыления.
   4. Напыляют слой молибдена толщиной 10 нм на стеклянную подложку с покрытием ITO (молибденовую мишень) со скоростью осаждения 0,7 Å/с и временем осаждения 140 с.
   5. Добавьте теневую маску на одну сторону стеклянной подложки, чтобы оставить 2 мм от края стеклянной подложки открытой для электрических соединений. Нанесение 1 мкм A:Si с использованием индуктивно связанного плазменно-плазменного усиленного химического осаждения из паровой фазы (ICP-PECVD), как описано в Medjdoub et ^al.25.
   6. Очистите предметное стекло газом N₂ для удаления пыли и других загрязнений. Для любого A:Si, нанесенного под теневую маску, погрузите край до отметки 2 мм в 25% мас./мас. раствор гидроксида калия для травления A:Si.
2. Изготовление микросхем LiDEP
   1. Чтобы сформировать микроканал, получите двусторонний скотч (52 мм х 25 мм) и проделайте отверстия (диаметр = 4 мм) на расстоянии 5-6 мм от края более короткого размера и по центру между более длинными сторонами ленты. С помощью скальпеля прорежьте две прямые линии (на расстоянии 3 мм друг от друга) поперек отверстий. Убедитесь, что защитные листы на обеих сторонах двустороннего скотча надеты на протяжении всего этапа микроканальной резки.
   2. Просверлите два отверстия диаметром 3 мм в верхнем предметном стекле ITO. Лента может быть выровнена поверх стекла с покрытием ITO, при этом длинный край ленты совпадает с длинным краем стекла. Отметьте место отверстия моющимся маркером. Убедитесь, что просверленные отверстия совпадают с отверстиями, пробитыми в двустороннем скотче. Эти два отверстия будут действовать как впускное и выходное отверстия микрофлюидного устройства.
   3. Снимите одну сторону защитной пленки с двустороннего скотча, совместите отверстия в ленте и верхнем предметном стекле ITO и прижмите их друг к другу. Аккуратно надавите, чтобы удалить воздушные карманы, особенно возле микроканала. Воздушные карманы могут позволить среде или другим растворам просачиваться под ленту, что может повредить или вызвать плесень в микрофлюидном устройстве.
   4. Снимите другую защитную пленку с двустороннего скотча и прижмите к молибдену и стеклу ITO с покрытием A: Si. Совместите край фотопроводящего предметного стекла, противоположный стороне зазора 2 мм, с краем двустороннего скотча, который находится по направлению к центру верхнего предметного стекла ITO. Будет похмелье от верхнего предметного стекла ITO и предметного стекла ITO с фотопроводящим материалом.
   5. Надавите на ровную поверхность, чтобы обеспечить хорошую адгезию. Схема стеклянной подложки и слоев двустороннего скотча проиллюстрирована на рисунке 1А. Отрежьте лишнюю ленту сбоку.
   6. Нанесите медную ленту на края слоя A и слоя C, чтобы подключить генератор функций. Сделайте это, обернув ленту со стороны ITO или фотопроводящего материала, в зависимости от того, является ли это слоем A или слоем C, от края двустороннего скотча примерно до 3 см на непокрытую сторону стеклянной подложки.
   7. Чтобы обеспечить успешное изготовление устройства, используйте мультиметр для проверки показаний сопротивления между предметными стеклами с покрытием обеих стеклянных подложек и медной лентой, прикрепленной к стеклу.
3. Подготовка буфера DEP
   1. Отмерьте 4,25 г сахарозы и поместите его в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем отмерьте 0,15 г глюкозы и поместите ее в ту же коническую пробирку объемом 50 мл.
   2. Наполните коническую пробирку 25 мл сверхчистой воды, закройте крышку и перемешайте. Как только примерно половина сахарозы и глюкозы растворится, заполните коническую пробирку сверхчистой водой до линии 50 мл. Энергично перемешивайте, пока вся сахароза и глюкоза не растворятся. Буферный раствор DEP содержит 8,5% (мас./об.) сахарозы и 0,3% (мас./об.) глюкозы.
   3. Получают 20 мл приготовленного раствора сахарозы и глюкозы и помещают его в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем отмерьте 0,1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) и поместите его в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую раствор сахарозы и глюкозы. Вихрь до тех пор, пока BSA не растворится. Конечный буферный раствор DEP содержит 0,5% (мас./об.) BSA.
4. Подготовка клеток
   1. Получите, по меньшей мере, 1 x 10⁶ клеток (hMSCs или HEK 293), суспендированных в 1 мл питательной среды, используя протокол культивирования клеток, описанный в предыдущих исследованиях^26,27. Поместите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 10 мл.
   2. Центрифугируйте клетки HEK 293 при 201 x g в течение 5 мин и hMSCs при 290 x g в течение 10 мин. После центрифугирования аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в 1 мл буферного раствора ДЭП с 0,5% БСА. Следите за тем, чтобы не добавлять буферный раствор слишком быстро, так как могут образоваться пузырьки.
   3. Повторите процесс центрифугирования еще два раза, а затем ресуспендируйте клетки в буфере DEP с 0,5% BSA для характеристики LiDEP. Приведенного протокола клеточной подготовки хватает на 10 прогонов. Например, для одного частотного теста требуется не менее 15 запусков, и, таким образом, необходимо сделать 2 мл клеток при концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл.

2. Характеристика LiDEP

1. Экспериментальная установка
   1. Для экспериментальной установки для количественной оценки клеточных реакций на LiDEP соберите следующее оборудование: ноутбук, проектор, объектив, цифровой микроскоп и генератор функций. Используйте ноутбук для создания световых проекций (звезда, ромб, три линии и овал) и подключите его к проектору.
   2. Используйте проектор в качестве источника света для отображения световых проекций на фотопроводящую поверхность (слой C) микросхемы LiDEP. Настройте его так, чтобы свет от источника света (проектора) проходил через 10-кратный объектив на микроканальную область чипа LiDEP. 10-кратный объектив устанавливается поверх объектива проектора. На дополнительном рисунке 1 показана интеграция проектора в систему LiDEP.
   3. Подключите микросхему LiDEP к генератору функций, чтобы подать электрическое поле переменного тока. Наблюдайте за клетками, испытывающими силу LiDEP, используя цифровой микроскоп для визуализации и видеозаписи. На рисунке 1В показана схема экспериментального аппарата. Следуйте стандартным протоколам клеточных культур^26,27 для всех тестируемых клеток.
2. Экспериментальные процедуры
   1. Промойте микроканал 70% этанолом, а затем 0,5% раствором BSA. Еще два раза промойте микроканал 0,5% раствором BSA, чтобы убедиться, что этанол и предыдущие клетки полностью смыты. Клетки, которые уже подвергались воздействию поля DEP, будут реагировать иначе, чем свежие клетки, и могут нарушить сбор данных.
   2. Удалите 0,5% раствор BSA с помощью пипетки и вставьте микрофлюидное устройство в держатель устройства.
   3. Прикрепите зажимы типа «крокодил» к каждому соединению медной ленты на устройстве. Установите функцию генератора на желаемое напряжение (напряжение от пика до пика, В_pp) и частоту (Гц). Испытанный здесь диапазон частот составлял от 30 кГц до 20 МГц.
   4. Добавьте 70 мкл клеточной суспензии (клетки + буферный раствор DEP с 0,5% BSA) в микроканал устройства. Из-за тонкости микроканала (~0,05 мм) может произойти утечка из впускного и выпускного отверстий. Чтобы уменьшить количество пролития, используйте меньший наконечник пипетки и слегка наклоните наконечник в отверстии к микроканалу. Любой раствор для доступа (0,5% BSA или клетки в растворе) можно стереть одноразовыми бумажными салфетками и выбросить в биологически опасные отходы.
   5. Проецируйте желаемую геометрию виртуального электрода (в данном случае круги, ромбы, звезды и/или параллельные линии) на микросхему LiDEP.
   6. В программном обеспечении цифрового микроскопа установите продолжительность видео на 3 минуты. Установите лабораторный таймер на 2 минуты 30 с. После того, как ячейки неподвижны в микроканале микросхемы LiDEP, нажмите « Пуск » в программном обеспечении цифрового микроскопа, чтобы начать процесс записи видео.
   7. Подождите 10 с, затем нажмите кнопку ВКЛ на выходе канала генератора функций, чтобы подать электрическое поле переменного тока, и нажмите «Пуск » для таймера. Контролируйте поведение DEP клетки с помощью цифрового микроскопа и предотвращайте дрожание или движение по установке.
   8. Как только таймер сработает, нажмите кнопку ВКЛ на выходе канала генератора функций. Это отключает выход канала функционального генератора, и электрическое поле переменного тока больше не подается через электроды. Остановите запись видео на 3 минуты и сохраните в цифровом микроскопе для будущего анализа.
   9. Пипеткой вытащите ячейки из выходного конца микросхемы LiDEP, медленно проталкивая 60 мкл буфера DEP с 0,5% BSA в микроканал и одновременно собирая на выходе. Продолжайте до тех пор, пока в микроканале практически не останется клеток.
   10. Повторяйте шаги 2.2.3-2.2.9 до тех пор, пока не будут проверены все частоты.

Results

Испытания напряжения и цвета электродов были завершены с использованием описанной выше процедуры с небольшими изменениями на шагах 2.2.3 и 2.2.10. Для испытания напряжением цвет и частота электродов оставались постоянными, и применялись 5 В pp, 10 В pp и 20 В_pp. Для испытания цвета электродов приложенное напряжение и частота поддерживались постоянными на уровне 30 кГц и 20 В_pp, а проецируемые электроды были исследованы синим, красным, белым и желтым (на которые ссылаются цветовые коды HEX #4472C4, #FF0000, #FFFFFF и #FFFF00 соответственно). Жизнеспособность клеток исследовали путем окрашивания клеток трипановым синим и подсчета количества живых и мертвых клеток с помощью гемоцитометра.

С помощью установки LiDEP мы смогли манипулировать hMSC и генерировать кривые отклика DEP в ответ на входную частоту, что является одним из способов характеристики электрического поведения ячеек. Была проведена серия экспериментов для поиска оптимальных условий работы путем манипулирования такими параметрами, как приложенное напряжение и цвет проецируемого электрода (т. е. формы с различными цветами, созданные с помощью программного обеспечения графического редактора), чтобы наблюдать за последовательным поведением ячейки в неоднородном электрическом поле переменного тока, генерируемом виртуальными электродами. Данные, собранные для клеточных ответов с использованием LiDEP, нетрадиционного DEP, сравнивались с результатами анализатора 3DEP, традиционного DEP.

Первый тест оптимизации был сосредоточен на положительном ответе DEP hMSC (т. е. клеток, движущихся к виртуальному электроду) в чипе LiDEP. Клетки, не проявляющие положительного ответа DEP, либо демонстрировали отрицательный ответ DEP, удаляясь от виртуального электрода, были неподвижными и вращающимися, либо не реагировали на электрическое поле. Реакция клеток была количественно определена путем отслеживания их скоростей (мкм/с) в ImageJ в течение 2 мин 30 с. Для виртуального электрода использовалась желтая овальная проекция, а приложенные напряжения 5 В pp, 10 В pp и 20 В_pp были исследованы на заданной частоте 30 кГц. Мы сосредоточились на ячейках, которые находились в пределах 50 мкм от виртуального электрода, в то время как электрическое поле переменного тока было включено для согласованности и минимизации выбросов. _{Напряжение} 20 В pp привело к самому быстрому движению ячеек HEK 293 со средней скоростью 0,035 мкм/с, за которым последовали 0,032 мкм/с при 10 В pp и 0,020 мкм/с при 5 В_pp, что означает, что эти ячейки представляют собой относительно однородный контроль. Аналогичная тенденция наблюдалась для hMSCs, которые имели среднюю скорость 0,051 мкм/с при 20 В pp, 0,036 мкм/с при 10 В pp и 0,025 мкм/с при 5 В_pp, как показано на рисунке 2A (здесь * указывает p <_0,05). При напряжении 20 В_pp наблюдалось, что hMSC одновременно испытывали положительный и отрицательный DEP. Это не наблюдалось при 10 В pp и 5 В pp. Результаты жизнеспособности hMSC после воздействия силы DEP показали, что более высокие напряжения обычно приводили к более низкой жизнеспособности клеток: 66% клеток жизнеспособны при 5 В pp, 58% клеток жизнеспособны при 10 В pp и 57% клеток жизнеспособны при 20 В _pp, как показано на рисунке 2B (здесь ** обозначает p < 0,01).

Поскольку LiDEP является оптической системой, интенсивность света и цвет электродов являются параметрами, которые можно легко настроить для управления производительностью чипа LiDEP. Здесь оценивались различные цвета электродов (белый, желтый, красный и синий), генерируемые на основе проецируемой формы, чтобы определить влияние на ответы клеток на DEP. Ячейки HEK 293 и hMSC оценивались при напряжении 20 В_pp и 30 кГц. Были выбраны электроды белого, желтого, красного и синего цветов, но на освещение через чип LiDEP влиял фотопроводящий слой, который имел красно-оранжевый цвет. Таким образом, проецируемый белый электрод казался желтым с белой внутренней частью, красный электрод казался оранжевым с красным контуром, а синий электрод казался светло-зеленым (рис. 3A-D). Выходная мощность для этих четырех цветов была следующей: 77,7 мкВт ± 0,7 мкВт, 92,7 мкВт ± 1,3 мкВт, 21,9 мкВт ± 0,2 мкВт и 56,7 мкВт ± 0,9 мкВт для белого, желтого, красного и синего соответственно. Это убедительно свидетельствует о том, что желтый и белый цвета имели самое сильное поле DEP, в то время как синий и красный были слабее, как показано на рисунке 3E (здесь *** указывает p < 0,001 для клеток HEK 293 и ** указывает p < 0,01 для hMSCs). Также наблюдалось стационарное вращение ячеек по краям желтых и белых виртуальных электродов во время приложения силы DEP. Для всех вариаций цвета электродов происходили одновременные отрицательные и положительные отклики DEP, коррелирующие с тем, что было показано при 20 В_pp для теста напряжения. Кроме того, в то время как скорость ячеек варьировалась в зависимости от цвета электрода, почти все клетки в пределах границы 50 мкм реагировали на LiDEP. Размер hMSCs был измерен как 19,2 мкм ± 5,8 мкм.

Чтобы оценить возможности LiDEP по сравнению с DEP с обычными электродами, мы оценили различия между поведением DEP клеток, использующих LiDEP, и поведением клеток, проанализированных анализатором 3DEP. Реакцию DEP hMSC измеряли в буферном растворе DEP с низкой проводимостью с 0,5% BSA (~ 100 мкСм/см). Чтобы имитировать анализатор 3DEP, один овальный желтый виртуальный электрод был спроецирован на 10 В_pp. Поведение DEP hMSC характеризовалось в диапазоне от 30 кГц до 20 МГц. На частотах ниже 25 кГц мы наблюдали электролиз, который приводил к образованию пузырьков на поверхности металлического слоя внутри микрофлюидного устройства. Для LiDEP на более низких частотах hMSC испытывали положительную силу DEP, как показано на рисунке 4A, представленную в виде процента клеток, притягиваемых к виртуальному электроду. Клетки начинали с сильной положительной силы DEP, которая ослабевала по мере увеличения частоты. Ячейки испытали самую сильную положительную силу DEP от 30 кГц до 97 кГц. После применения электрического поля переменного тока на этих частотах некоторые клетки перестали реагировать, в то время как другие клетки показали отрицательное поведение DEP. Эта тенденция отклоняется от наблюдаемого отклика, количественно оцененного с помощью анализатора 3DEP; ячейки увеличили положительный DEP с 37 кГц до 255 кГц и уменьшили положительный DEP с 1,772 кГц до 20 МГц, как показано на рисунке 4B.

Рисунок 1: Экспериментальная установка для протокола LiDEP, описанного здесь для hMSCs. (A) Схематическое и реальное изображение микросхемы LiDEP с фотопроводящим слоем и экспериментальной установкой. (B) Репрезентативные изображения положительных и отрицательных ответов клеток на DEP в анализаторе 3DEP (с использованием обычных электродов DEP, вверху) и схематическое изображение положительных и отрицательных ответов DEP клеток с использованием LiDEP (с использованием световых проекций в качестве виртуальных электродов, внизу). (C) Примеры различных форм, которые могут быть спроецированы на устройство в виде виртуальных электродов. Рисунок создан с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Характеристика DEP-реакций (скорости) hMSC и их жизнеспособность в данных условиях. (A) Измеренные скорости положительных ответов DEP hMSC на 5 В pp, 10 В pp и 20 В _pp. МСК двигались со скоростью 0,051 мкм/с при 20 В pp, 0,036 мкм/с при 10 В pp и 0,025 мкм/с при 5 В _pp. (B) Жизнеспособность hMSC после того, как вы испытали положительную силу DEP, генерируемую виртуальными электродами. Жизнеспособность составила 57%, 58% и 66% для 20 В pp, 10_{В pp} и 5_{V pp} соответственно. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD). Статистический анализ выполнен на объединенных наборах данных с использованием t-тестов (*p < 0,05 и **p < 0,01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Сравнение ответов DEP между гомогенными (HEK 293) и гетерогенными (hMSCs) клеточными линиями. Положительный ответ DEP клеток hMSCs на (A) белый, (B) желтый, (C) красный и (D) синий электроды при 20 В_pp и 30 кГц. (E) Скоростные отклики ячеек HEK 293 и hMSC на электроды разного цвета. Ячейки HEK 293 показали самые высокие скорости с желтым и красным электродами при 0,035 мкм/с и 0,033 мкм/с соответственно. Ячейки HEK 293 показали самую низкую скорость с синими электродами при 0,027 мкм / с. МСК показали самые высокие скорости с желтым и белым электродами при 0,068 мкм/с и 0,049 мкм/с соответственно. У hMSC наблюдалась самая низкая скорость с красными электродами - 0,039 мкм / с. Полосы погрешностей представляют SD. Статистический анализ, выполненный на объединенных наборах данных с использованием t-тестов (*p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Сравнение ответов DEP hMSC с использованием LiDEP и 3DEP. Отклики DEP hMSCs, измеренные с помощью (A) LiDEP и (B) анализатора 3DEP при 10_{В pp}. При использовании LiDEP наблюдалось затухание положительного DEP-отклика hMSC с 30 кГц до 20 МГц. В анализаторе 3DEP ячейки увеличили положительный DEP с 37 кГц до 255 кГц и уменьшили положительный DEP с 1,772 кГц до 20 МГц. Полосы погрешностей представляют SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Репрезентативные изображения установки LiDEP, используемой для экспериментов в этом протоколе. Увеличенное изображение системы LiDEP, демонстрирующее интеграцию проектора. Свет проходит от источника (проектора) через 10-кратную линзу объектива на микроканал чипа LiDEP. 10-кратный объектив находится в верхней части объектива проектора. Каждый компонент пронумерован на рисунках и указан сбоку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 1: Репрезентативное видео hMSCs, реагирующих на белые, желтые, красные и синие виртуальные электроды. Клетки визуализируются как испытывающие положительный DEP (движущийся к виртуальному электроду), испытывающий отрицательный DEP (удаляющийся от виртуального электрода), неподвижные и вращающиеся или не реагирующие на электрическое поле. hMSC были протестированы на частоте 37 кГц и 20 В_pp, а видео было ускорено в 20 раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Изучение гетерогенности МСК важно для их продвижения в терапии. Эта работа представляет собой первый шаг к использованию LiDEP в качестве аналитического инструмента для оценки hMSCs. Мы изучили зависимость напряжения положительного ответа DEP ячеек в LiDEP путем количественной оценки скорости. Ожидается, что более высокие напряжения должны создавать более сильную положительную силу DEP, и мы наблюдали эту закономерность с измеренными скоростями. Напряжения 10 В pp и 20 В_pp были достаточными для манипуляций с hMSC с использованием LiDEP. Более низкие напряжения (т.е. 5 В_pp) приводили к более медленным откликам ячеек; хотя это и не оптимально для hMSCs, это может быть полезно для других типов клеток. Наблюдалось зависящее от напряжения снижение жизнеспособности hMSCs примерно на 9%. Это немного отличается от предыдущей литературы 6,12,28,29^, в которой использование традиционных DEP и LiDEP при исследовании биологических клеток не снижало жизнеспособность клеток. Однако экспериментальная цель в каждом исследовании варьировалась. Глассер и Фур наблюдали за ростом адгезивных мышиных фибробластов L929 на металлических электродах в среде^{культивирования клеток 28}. И наоборот, Lu et al. исследовали жизнеспособность нейральных стволовых клеток, подвергшихся воздействию электрических полей переменного тока в течение разных периодов времени¹². Adams et al. охарактеризовали диэлектрические свойства hMSCs с помощью металлических электродов¹², а Li et al. манипулировали лейкозными клетками с помощью LiDEP²⁹. Разница между этими исследованиями и нашими заключалась в использовании BSA, что может быть причиной наблюдаемого нами снижения жизнеспособности. Однако более низкая общая жизнеспособность также может быть связана со временем воздействия (2 мин 30 с), используемым в протоколе, установленном здесь. Это время было выбрано для того, чтобы обеспечить достаточно времени для визуализации манипуляций с клетками во время воздействия неоднородного электрического поля переменного тока.

Методы характеристики клеток были протестированы с помощью цвета электрода, чтобы определить возможности и ограничения нашей системы LiDEP, построенной так, как описано в протоколе. В этом конкретном протоколе цветом электрода можно управлять на основе цвета формы, проецируемой через файл графического редактора. Мы использовали четыре цвета: белый, желтый, красный и синий. Исходя из показаний выходной мощности для каждого цвета, проецируемые желтые (#FFFF00) и белые (#FFFFFF) электроды имели более высокую интенсивность, что было основой того, почему эти цвета были более благоприятными для использования в последующих экспериментах. Кроме того, из-за установленной зависимости интенсивности света фотопроводящих материалов^30,31 результаты свидетельствуют о том^, что производительность устройств LiDEP зависит от фотопроводящих A:Si и может быть настроена путем выбора цвета проецируемого электрода. Сочетание положительных и отрицательных ответов DEP hMSC также наблюдалось с использованием LiDEP, что похоже на явление, наблюдаемое в традиционных методах DEP. С каждым цветом электродов hMSC испытывали отрицательную силу DEP, положительную силу DEP и вращение клеток, что указывает на то, что образец клетки был неоднородным на одной частоте (Дополнительное видео 1). Это согласуется с выводами Adams et ^al.6 о том, что hMSC демонстрируют как отрицательное, так и положительное поведение DEP на одной частоте. Эти условия (цвет электрода, форма электрода и фотопроводящий материал) могут обеспечить дополнительные параметры для определения уровня гетерогенности в образцах hMSC.

Наконец, результаты оценки LiDEP сравнивались с результатами анализатора 3DEP в качестве эталона поведения hMSC DEP. Наблюдалась разница в диапазоне частот положительного ответа DEP hMSCs, но тенденции в данных, собранных с помощью LiDEP и анализатора 3DEP, были в целом схожими (т.е. положительный ответ DEP уменьшался с увеличением частоты). Когда электрическое поле переменного тока подавалось на микросхему LiDEP и на нее проецировался свет, проводимость в области внутри световой проекции падала, создавая неоднородное электрическое поле. Следовательно, характеристики источника света (т.е. интенсивность и длина волны) влияют на ожидаемую реакцию ячеек в чипе LiDEP, как видно из результатов испытаний на изменение напряжения и цвета электродов. Другими параметрами, которые могут быть изменены, являются материал фотопроводящего слоя и проводимость буферного раствора DEP. Таким образом, условия, используемые для оценки поведения клеток DEP, должны оцениваться на основе настройки системы LiDEP. И наоборот, для анализатора 3DEP или других методов, в которых используются металлические электроды для приложения силы DEP, характеристики электродов постоянны и не могут быть мгновенно изменены, чтобы адаптироваться к тому, что необходимо для исследуемых ячеек. Эта вариация положительного поведения DEP может быть полезна для будущих исследований характеристик различных типов клеток в образцах hMSC, анализа отдельных клеток или сортировки клеток. Кроме того, по мере того, как ячейки удаляются от виртуальных электродов, электрическое поле переменного тока становится слабее. Однако с помощью анализатора 3DEP или других традиционных режимов DEP, в которых используются металлические электроды, может быть применена большая область электрического поля, что позволяет манипулировать большим количеством ячеек. Таким образом, меньшее количество ячеек в эксперименте LiDEP испытало воздействие электрического поля переменного тока в микроканале чипа LiDEP. Дальнейшие расхождения могут быть вызваны изменениями производительности устройства с течением времени (т. е. 2 ч или 3 ч), которые все еще исследуются. Постоянный поток воды, этанола и буферного раствора DEP может разрушить поверхность микроканального слоя (т. е. фотопроводящего материала), и его необходимо учитывать. Производительность устройства с течением времени для определения характеристик ячеек также должна учитываться при расширенном использовании одного чипа LiDEP. Изменение экспериментальных параметров в режиме реального времени занимало от нескольких секунд до нескольких минут. Цвет и геометрия электродов были мгновенно скорректированы с помощью настроек в программном обеспечении графического редактора.

Таким образом, эта статья демонстрирует возможности LiDEP манипулировать и характеризовать клеточную линию с гетерогенными клеточными популяциями, такими как hMSCs. Используя эту установку и описанный протокол, мы смогли добиться успешной характеристики hMSC в условиях 20 В_pp и проецируемых виртуальных желтых электродов. Будущие исследования должны быть сосредоточены на корректировке времени воздействия hMSC электрическим полем переменного тока, создаваемым с помощью LiDEP, увеличении интенсивности света виртуальных электродов и оценке различных источников hMSC (или других популяций стволовых клеток) для разработки каталога LiDEP электрических сигнатур гетерогенных популяций стволовых клеток.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Трипсин-ЭДТА	Gibco	25300054
10-кратный объектив	AmScope	---
Аморфный кремний (A:Si)	Millipore Sigma	S5130
Антибиотик-антимикотик (100X)	Gibco	15240-062
Бычья сыворотка альбумин (БСА)	Fisher	BP9706-100
Медная лента	Zehhe	BF4964
Декстроза (глюкоза)	Fisher	D16-1
Цифровой микроскоп	Keyence	VHX-7000
Двусторонняя лента	Инсулектро	FLX000484
фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS)	Gibco	14190-144
Fetel Сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Corning	35-011-CV
Генератор функций	Tektronix	AFG 31102
Графический редактор программного обеспечения	Microsoft Office Powerpoint	---
Индий, олово, оксид, покрытые стеклом, слайды	MSE В комплекте	GL0333
L-аланил-L-глутамин	ATCC	PCS-999-034
Ноутбук	Dell	Inspiron 14, 2-в-1
Мезенхимальные стволовые клетки базальные Medium	ATCC	PCS-500-030
Набор для роста мезенхимальных стволовых клеток для МСК, полученных из пуповины и жировой пуповины	ATCC	PCS-500-040
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X)	Giblo	A10490-01
Молибден, 99,95%	Kurt J. Lesker	EJTMOXX352A4	Распыляющаяся мишень
Phenol Red	Sigma	P5530
Измеритель мощности	Thor Labs	S130VC/PM400
Проектор	Vecupoi	---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media	Gibco	11875-093	Этот фильтрующий материал содержит L-глютамин и феноловый красный.
Сахароза	Fisher	BP220-1
Трипановый синий морилка	Gibco	15250-061	0,40%
Нейтрализатор трипсина	Gibco	R002100
Система вакуумного распыления	Denton	DV-502M