يتضمن البروتوكول المقترح إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالذيفان الداخلي أثناء عزل الحويصلات خارج الخلية من طافات زراعة الخلايا ، وكيفية تقييمها بشكل صحيح.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الحويصلات خارج الخلية ذات المحتوى المنخفض من السموم الداخلية المشتقة من خطوط الخلايا السرطانية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي مجموعة غير متجانسة من الحويصلات الغشائية التي تطلقها الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي. إن وجودها في كل مكان ودورها الهام كحاملين للمعلومات البيولوجية يجعلها كائنات دراسة مثيرة للاهتمام ، وتتطلب بروتوكولات موثوقة ومتكررة لعزلها. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتهم الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات التقنية المتعلقة بأبحاثهم (مثل الاستحواذ المناسب). تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لعزل المركبات الكهربائية الصغيرة (وفقا لتسمية MISEV 2018) من طاف الثقافة لخطوط الخلايا السرطانية على أساس الطرد المركزي التفاضلي. يتضمن البروتوكول إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالسموم الداخلية أثناء عزل المركبات الكهربائية وكيفية تقييمها بشكل صحيح. يمكن أن يؤدي تلوث السموم الداخلية للمركبات الكهربائية إلى إعاقة التجارب اللاحقة بشكل كبير أو حتى إخفاء آثارها البيولوجية الحقيقية. من ناحية أخرى ، قد يؤدي التغاضي عن وجود السموم الداخلية إلى استنتاجات غير صحيحة. هذا له أهمية خاصة عند الإشارة إلى خلايا الجهاز المناعي ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة ، لأن الوحيدات تشكل مجموعة حساسة بشكل خاص لبقايا السموم الداخلية. لذلك ، يوصى بشدة بفحص EVs بحثا عن تلوث السموم الداخلية ، خاصة عند العمل مع الخلايا الحساسة للسموم الداخلية مثل الخلايا الوحيدة أو الضامة أو الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع أو الخلايا المتغصنة.
المقدمة
الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، وفقا لتسمية MISEV 2018 ، هي مصطلح جماعي يصف أنواعا فرعية مختلفة من الحويصلات الغشائية التي تفرزها الخلايا والتي تلعب أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية 1,2. علاوة على ذلك ، تظهر المركبات الكهربائية واعدة كمؤشرات حيوية جديدة لمختلف الأمراض ، بالإضافة إلى العوامل العلاجية ووسائل توصيل الأدوية. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتها الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات الفنية المتعلقة بالاستحواذ عليها3. أحد هذه التحديات هو عزل المركبات الكهربائية الخالية من السموم الداخلية ، والتي تم إهمالها في كثير من الحالات. واحدة من السموم الداخلي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد أنابيب الطرد المركزي الفائقة
- استخدم أنابيب معقمة تستخدم مرة واحدة. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فأعد استخدام أنابيب الطرد المركزي الفائقة بعد غسلها بمنظف باستخدام ماصة باستور معقمة أو غيرها من أدوات التطبيق ذات الاستخدام الواحد. تذكر أن أنابيب الطرد المركزي الفائقة يجب أن تكون مخصصة لنوع واحد من مواد الطرد المركزي (طاف زراعة الخلايا / المصل / البلازما) والأنواع (الإنسان / الفأر / إلخ).
- بعد غسل المنظفات ، اشطف أنابيب الطرد المركزي الفائقة بماء منزوع الأيونات وخالي من LPS 3x.
ملاحظة: لا تستخدم مياه منخفضة الجودة. - جفف أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، ثم املأها بنسبة 70٪ من الإيثانول. اترك الأنابيب مع 70 ٪ من الإيثانول لل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشرط الأساسي أو الخطوة الإلزامية لهذا البروتوكول هي استبعاد التلوث المحتمل للسموم الداخلية من الكواشف. يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة ، مثل FBS و DMEM و RPMI و PBS وحتى أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، خالية من السموم الداخلية (<0.005 EU / mL). إن الحفاظ على نظام عدم التلوث بالذيفان الداخلي ليس بالأمر السهل ، على سبيل المثال ، يمكن أن يكون المصل العادي / القياسي لزراعة الخلايا مصدره الغني (0.364 EU / mL ؛ انظر الجدول 1).
على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تطويره لعزل المر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في السنوات القليلة الماضية ، أصبحت طرق عزل المركبات الكهربائية المناسبة ذات أهمية متزايدة ، مما يتيح إجراء مزيد من التحليلات الموثوقة ، على سبيل المثال ، في سياق الحصول على بيانات أوميكس وبيانات وظيفية موثوقة24. بناء على الخبرة البحثية السابقة ، يبدو أنه ليس فقط نوع طريقة العزل ، ولكن أيضا الحالات الأخرى أثناء هذا الإجراء قد تكون مهمة. من المسلم به على نطاق واسع أن استخدام FBS المستنفدة للمركبات الكهربائية ضرورة25,26 ؛ ومع ذلك ، غالبا ما ي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن بناؤها كتضارب محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا ، رقم المنحة 2019/33 / B / NZ5 / 00647. نود أن نشكر البروفيسور توماس جوسيفسكي وأغنيسكا كراوتشيك من قسم علم الأحياء الدقيقة الطبية الجزيئية ، كلية الطب بجامعة جاجيلونيان على مساعدتهم التي لا تقدر بثمن في الكشف عن الحمض النووي البكتيري في المركبات الكهربائية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Alix (3A9) ماوس mAb | تقنية إشارات الخلية | 2171 | |
| 1250ul مرشح أطراف ماصة عالمية ، شفاف ، بولي بروبيلين ، غير بيروجينيك | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1 / Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) تقنية | إشارات خلية | mAb 13174 | |
| نظام التصوير ChemiDoc | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco' s النسر المعدل s متوسط) | كورنينج | 10-013-CV | |
| ELX800NB ، قارئ صفيحة دقيقة عالمي | BIO-TEK INSTRUMENTS ، INC | ||
| مصل الأبقار الجنيني | جيبكو | 16000044 | |
| مصل الأبقار الجنين أمريكا الجنوبية السموم الداخلية المنخفضة | للغاية ؛ Biowest | S1860-500 | |
| جنتاميسين ، 50 مجم / مل | ؛ PAN – Biotech | P06-13100 | |
| الماعز المضادة للفأر IgG- HRP | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-2004 | |
| الماعز المضادة للأرانب IgG- HRP | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF غشاء | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS من السالمونيلا المجهضة أسوا شكل S (TLRGRADE) | ؛ شركة إنزو لعلوم الحياة | ALX-581-009-L002 | |
| مختبرات Bio-Rad الخلوية الكهربائية المصغرة عبر اللطخة | 1703930 | ||
| تحليل تتبع الجسيمات النانوية | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS عينة عازلة (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| اختزال عينة NuPAGE (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | فيلم شفاف |
| مثالي 100-1000 نقطة أساس سلم الحمض | النووي EURx | E3141-01 ؛ | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube مع أغطية مانعة للتسرب | Thermo Scientific | 3929 ، 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX + ULTRA SERIES الطرد المركزي مع دوار | T-1270Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT نظام الرحلان الكهربائي الأفقي | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS الركيزة الكيميائية | الحرارية العلمية | 34577 | |
| SW480 خط الخلية | الثقافة من النوع الأمريكي (ATCC) | ||
| SW480 خط الخلية | الثقافة من النوع الأمريكي (ATCC) | ||
| مرشح حقنة 0.22 um | TPP | 99722 | |
| خلية نقل شبه جافة عبر اللطخة SD | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | آلة نقل |
| ماصة النقل ، 3.5 مل | SARSTEDT | 86.1171.001 |
المراجع
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
- Yáñez-Mó, M., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
