환자 유래 난소암 오가노이드로 치료 약물 테스트를 수행하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
난소암은 치명적인 부인과 암이며 미국 여성의 암 사망 원인 중 5위를 차지합니다. 신약 치료법 개발은 의료 서비스를 발전시키고 환자 결과를 개선하는 데 매우 중요합니다. 오가노이드는 체외 3차원 다세포 소형 장기입니다. 난소암의 환자 유래 오가노이드(PDO) 모델은 2차원 세포 배양 모델보다 관심 조직을 더 정확하게 재현하고 환자 유래 이종이식에 비해 저렴하기 때문에 약물 스크리닝에 최적일 수 있습니다. 또한 난소암 PDO는 난소암에서 일반적으로 관찰되는 다양한 종양 미세환경 및 유전적 배경을 모방합니다. 여기에서, 난소암 조직 및 복수로부터 유래된 PDO에 대한 종래의 약물 및 신규약을 시험하는데 사용될 수 있는 방법이 설명된다. 발광 기반 아데노신 삼인산(ATP) 분석은 생존율, 성장률 및 약물 민감도를 측정하는 데 사용됩니다. PDO의 약물 스크리닝은 오가노이드 형성 속도 및 약물 치료에 따라 7-10일 이내에 완료될 수 있습니다.
서론
드물기는 하지만 난소암은 가장 치명적인 부인과 암중 하나입니다 1,2. 새로운 치료법 개발의 어려움은 난소암이 이질적이고 종양 미세환경이 환자마다 크게 다르다는 것입니다. 또한 많은 난소암에서 백금계 화학요법 및 폴리(ADP-리보스) 중합효소 억제제에 대한 내성이 발생하여 더 많은 치료 옵션이 필요함을 강조합니다 3,4,5.
새로운 치료제를 식별하는 데 유용할 수 있는 한 가지 접근법은 환자 유래 오가노이드(PDO)를 사용하는 것입니다. 오가노이드는 자가 조직화되어 체외 "미니 장기"를 형성하는 여러 세포 유형의 3차원 클러스터입니다6,7,8,9,10. 오가노이드는 중요....
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프로토콜
이 연구를 위한 인체 표본 수집은 Washington University School of Medicine Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. 18세 이상의 모든 적격 환자는 고등급 장액성 난소암 진단을 받았거나 추정 진단을 받았으며 정보에 입각한 동의를 제공할 의사와 능력이 있었습니다. 복수 및 흉수액 외에도 원발성 또는 전이성 부위의 종양 조직은 치료 당시 동의한 환자로부터 얻었다.
1. 생존도 분석을 위한 확립된 PDO 선택
참고: 일반적으로 이러한 오가노이드는 처음 5개 구절 내에 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이, 난소암 PDO는 Cultrex 또는 Matrigel17 과 같은 기저막 추출물(BME)에서 일차 세포 현탁액을 재현탁시킴으로써 형성된다( 재료 표 참조).
- PDO는 분석의 최상의 효율성을 위해 24-72시간의 인지된 배증 시간을 가져야 합니다. passaging/plating 후 오가노이드가 형성되는 데 걸리는 일수를 시각적으로 결정하여 인지된 배증 시간을 추정합니다.
참고: 경험상 형성에 3일 이상 걸리는 오가노이....
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결과
이 결과는 난소암 치료에 사용되는 화학 요법 약물 카보플라틴에 대한 두 PDO의 반응을 보여줍니다. 오가노이드는 종양 생검(PDO #1) 및 복수(PDO #2)에서 파생되었습니다. 이러한 오가노이드는 인지된 배증 시간(1-2일)과 형태학적 외관(많은 대형 오가노이드 형성)을 기반으로 선택되었습니다. PDO #1 및 PDO #2는 모두 -2일째 2개 통로에서 도금되었고, 0일째에 카보플라틴이 첨가되었습니다. Advance 오가노이드 배지에 희석한 카보플라틴 농도를 1, 5, 10, 25, 50 및 75μM로 테스트했습니다. 7일째 실험 종료 시 생존도 분석 시약을 플레이트에 첨가하고 결과를 분석했습니다. 그림 2A 는 카보플라틴 처리 후 살아있는 세포의 비율을 보여줍니다.
다음으로 온라인 GR 계산기를 사용하여 데이터를 분석했습니다. 세포 수 데이터가 없는 경우, 생존도 분석에서 측정된 발광 값을 사용했습니다. GR 메트릭스를 .......
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토론
이 논문에서는 난소암 PDO에 대한 기존 또는 신규 약물의 치료 효과를 평가하는 데 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 연구자는 PDO 모델에서 생존도 분석을 수행하기 전에 몇 가지 문제를 고려해야 합니다.
첫째, 생존도 분석에 사용할 PDO를 선택할 때 필요에 맞는 이상적인 오가노이드 유형(종양 대 복수)과 통로 수를 결정해야 합니다. 경험에 비추어 볼 때, 복수 유래 PDO는 종양 유래 PDO보다 더 빠르게 성장하고 생성하기도 더 쉽습니다. 이 분석은 성장 속도에 따라 달라지기 때문에 형성/성장에 오랜 시간이 걸리는 오가노이드를 사용하는 것은 어려울 수 있습니다. 우리는 배가시간이 4일 미만인 PDO 라인만 성공적으로 사용했습니다.
둘째, 이 연구에서는 불투명한 검은색 96웰 플레이트를 사용했습니다. ATP 생존도 분석은 발광 기반이기 때문에 투명한 웰은 신호 강도를 줄이고 신호 오염을 생성합니다. 불투명한 벽.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립암연구소(National Cancer Institute)의 지원을 받아 R01CA243511번 상을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 Deborah Frank의 편집 의견에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 플라스틱 튜브 | |||
| 15 mL 플라스틱 튜브 | |||
| 96 웰 플랫 블랙 플레이트 | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin 참조; | 테바 제약 미국 | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D 실행 가능성 | 프로메가 | G9681 | |
| 컬트렉스 | R & D 시스템 | 3533-010-02 | |
| DMSO | 시그마 알드리치 | D2650-100ML | |
| 글루타맥스 | 생명 기술 | 35050061 | |
| GR 계산기 | 온라인 계산기 | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| 페니실린-스트렙토마이신 | Thermo Fisher | 15140122 | |
| 플레이트 로커 | |||
| 멸균 P10, P200 및 P1000 배리어 멸균 피펫 팁 | |||
| 멸균 P10, P200 및 P1000 피펫 | |||
| Tecan Infinte 200Pro 플레이트 리더, i-Control 소프트웨어 | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | 오가노이드 해리 시약 |
참고문헌
- Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m, Karlan, B. Y. Ovarian cancer. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16061(2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Christie, E. ....
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재인쇄 및 허가
