本研究描述了一种小鼠模型，用于研究尼古丁在实验性矽肺小鼠肺纤维化进展中的协同作用。双重暴露小鼠模型可模拟尼古丁与二氧化硅同时暴露后肺部的病理进展过程。所述方法简便且具有高度可重复性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
利用尼古丁在二氧化硅暴露的小鼠模型中促进肺上皮-间质转化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
吸烟和接触二氧化硅在职业人群中较为普遍，而二氧化硅对吸烟者肺部的损伤风险高于非吸烟者。香烟中主要的成瘾成分尼古丁在矽肺病发展中的作用尚不明确。本研究采用的小鼠模型结构简单且易于控制，能够有效模拟长期摄入尼古丁和反复接触二氧化硅通过上皮-间质转化对人类肺纤维化的影响。此外，该模型有助于直接研究尼古丁对矽肺病的作用，同时避免香烟烟雾中其他成分的干扰。
经过环境适应后，小鼠每日早晚间隔12小时，在颈背部松散皮肤处皮下注射0.25 mg/kg的尼古丁溶液，持续40天。此外，将结晶型二氧化硅粉末（1–5 µm）悬浮于生理盐水中，稀释成20 mg/mL的悬浮液，并使用超声水浴均匀分散。小鼠在异氟烷麻醉状态下经鼻吸入50 µL该二氧化硅粉尘悬浮液后苏醒。 通过 胸部按摩。二氧化硅暴露在第5至19天每天进行。
双暴露小鼠模型先暴露于尼古丁，随后暴露于二氧化硅，这模拟了同时接触这两种有害因素的工人暴露史。此外，尼古丁通过促进小鼠的上皮-间质转化（EMT）加重了肺纤维化。该动物模型可用于研究多种因素对矽肺病发生发展的影响。
引言
在某些职业环境中，工人接触二氧化硅是不可避免的，且一旦暴露于二氧化硅，即使脱离该环境，病情仍会持续恶化。此外，这些工人中大多数有吸烟习惯，而传统香烟含有数千种化学物质，其中主要成瘾成分为尼古丁1。电子烟在年轻人群中正变得越来越流行2；这些电子烟作为尼古丁输送系统，增加了尼古丁的可及性，从而提高了肺部易感性和肺炎风险3。香烟烟雾还会加速博来霉素暴露小鼠的肺纤维化过程4，并增加二氧化硅暴露小鼠的肺毒性及肺纤维化程度5,6。然而，尼古丁是否会影响二氧化硅引起的炎症反应和肺纤维化过程，仍有待进一步研究。
通过一次性向气管内吸入高剂量二氧化硅建立的矽肺小鼠模型对小鼠创伤较大。尽管该方法可快速获得矽肺模型，但与工人在实际环境中反复暴露于二氧化硅的情况不符。因此，我们通过反复给予低剂量二氧化硅悬液，建立了一种二氧化硅暴露小鼠模型 通过 鼻腔滴注；该剂量可在小鼠中引起炎症和纤维化。
为了规避香烟中其他成分的影响，本小鼠模型通过皮下注射的方式将尼古丁注入颈部松弛的皮肤，以确定成瘾性成分尼古丁对矽肺病的影响。通过皮下注....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有操作均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NRC 第8版）发布的指南进行，并经安徽科技大学动物伦理委员会批准。
1. 动物准备
- 将32只8周龄雄性C57/BL6小鼠饲养在具有12小时光照/12小时黑暗循环的实验室中。确保小鼠可自由获取食物和水。
- 经过2周环境适应后，当10周龄小鼠体重达到23–26 g时，使用计算机生成的随机数字将动物随机分为四组，不进行区组划分，分别为：对照组（Con）、尼古丁组（Nic）、二氧化硅组（SiO2）以及尼古丁联合二氧化硅组（Nic+ SiO2）。
2. 尼古丁溶液的配制
注意：尼古丁的密度为 1.01 g/mL。
- 将尼古丁溶解于无水乙醇中，并稀释20倍，配制浓度为50 mg/mL的尼古丁储备液。
- 用无菌生理盐水将尼古丁储备液稀释1,000倍，得到浓度为0.05 mg/mL的工作溶液。
注意：尼古丁需避光保存。储备液可在4 °C下保存最多1周。
3. 二氧化硅制备
-
....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
建立了一种尼古丁联合二氧化硅暴露的小鼠模型，用于研究尼古丁在小鼠矽肺病进展中的潜在作用。图1展示了采用双暴露小鼠模型的实验流程，该模型结合了尼古丁注射与二氧化硅悬浮液的鼻腔滴注。通过HE染色观察各组小鼠的病理变化。与单独暴露于尼古丁或二氧化硅的小鼠相比，尼古丁联合二氧化硅暴露组小鼠的肺损伤显著更严重。尼古丁暴露组小鼠肺部淋巴管周围淋巴细胞增多，形成炎性细胞簇。Masson染色显示，与其余各组相比，尼古丁联合二氧化硅暴露组小鼠肺组织中胶原纤维沉积显著增加，该结果得到了Masson染色定量分析的支持（图2）。二氧化硅暴露组小鼠肺泡结构遭到破坏，巨噬细胞数量增加。然而，在尼古丁联合二氧化硅暴露后，出现明显的炎性细胞浸润，并可见成纤维细胞结节。此外，双暴露组中积累了大量巨噬细胞，尤其是M2型巨噬细胞。M2型巨噬细胞在矽肺病的晚期纤维化阶段中起关键作用。
此外，通过免疫组织化学（IHC）染色发现，双暴露小鼠肺组织中促纤维化因子 TGF-β1 显著升高，尤其在淋巴管周围的炎性.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了研究尼古丁与结晶型二氧化硅同时暴露的作用及其潜在机制，需要建立一种双重暴露的动物模型。本研究通过皮下注射尼古丁和鼻腔滴注二氧化硅的方法实现了该模型。为确保尼古丁注射成功，操作者必须熟练掌握小鼠抓持技术，因为抓握小鼠颈背部皮肤可能对其造成疼痛。因此，让小鼠逐步适应抓持过程至关重要。此外，小鼠二氧化硅暴露的关键步骤是鼻腔滴注。为了提高操作成功率及小鼠的存活率，事先练习鼻腔滴注技术十分必要。
注射时，应将注射器从鼠头上方掠过，以避免小鼠看到注射器后剧烈挣扎。用右手牢固抓住小鼠尾巴，同时用左手小心轻柔地将颈背部皮肤向上推至耳缘处，并捏住该处皮肤。右手松开小鼠尾巴后，应用左手拇指和无名指固定尾巴及后肢，以防被咬伤。用右手持1 mL注射器，将针头以30°角沿头部至尾部方向刺入颈背部松弛的皮肤。当阻力消失后，应将针头略微回撤，然后缓慢而均匀地进行注射。在第5至19天，双暴露组小鼠接受尼古丁和二氧化硅暴露。建议于上午08:00注射尼古丁，下午14:00进行二氧化硅鼻滴，晚上20:00再次注射尼古丁。两次尼古丁注射需间隔12小时，以避免频繁抓握对小鼠造成影响。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
所有作者均声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由安徽省高校协同创新计划项目（GXXT-2021-077）和安徽理工大学研究生创新基金（2021CX2120）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 中性福尔马林固定液 | 南昌玉路实验设备有限公司 | ||
| 酒精消毒剂 | 新泰矿业消毒产品有限公司 | ||
| BSA，第五组分 | 碧云天生物技术 | ST023-200g | |
| CD206 单克隆抗体 | Proteintech | 60143-1-IG | |
| 柠檬酸抗原修复液 | 百奥舍生命科学 | BL619A | |
| 二甲苯 | 西亚化学科技（山东）有限公司 | ||
| 增强型 BCA 蛋白检测试剂盒 | 碧云天生物技术 | P0009 | |
| GAPDH 多克隆抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 苏木精和伊红（H&和 E) | 碧云天生物技术 | C0105S | |
| HRP底物 | 默克密理博公司 | P90720 | |
| HRP标记的Affinipure山羊抗小鼠IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP标记的Affinipure山羊抗兔IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV 过氧化物酶（HRP）底物 | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| 马松三色染色试剂盒 | Solarbio | G1340 | |
| 甲醇 | Macklin | ||
| 尼古丁 | Sigma | N-3876 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Biosharp | BL601A | |
| 生理盐水 | 淮南市第一人民医院 | ||
| PMSF | 碧云天生物技术 | ST505 | |
| 正荧光显微镜 | 奥林巴斯公司 | BX53+DP74 | |
| 预染色蛋白质分子量标准 预染彩色蛋白分子量标准 | 碧云天生物技术 | P0071 | |
| PVDF膜 | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA裂解缓冲液 | 碧云天生物技术 | P0013B | |
| SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒 | 碧云天生物技术 | P0012A | |
| 二氧化硅 | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| 波形蛋白多克隆抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| <强>材料/设备名称 | 公司 | 货号 | |
| 0.5 mL 离心管 | Biosharp | BS-05-M | |
| 振荡恒温金属浴 | 阿布森 | ||
| 石蜡包埋机 | 常州精准医疗设备有限公司 | PBM-A | |
| 石蜡切片机 | 金华东瑞仪器有限公司 | ||
| 移液器 | Eppendorf | ||
| 偏光显微镜 | Olympus | BX51 | |
| 精密天平 | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT 智能多功能水净化系统 | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 三维摇床 | Scilogex | ||
| 小型动物麻醉机 | 安徽耀坤生物科技有限公司 | ZL-04A | |
| 通用移液器吸头 | KIRGEN | KG1011 | |
| 通用移液器吸头 | KIRGEN | KG1212 | |
| 通用移液器吸头 | KIRGEN | KG1313 | |
| 涡旋混合 混匀器 | VWR | ||
| <强>材料/设备名称 | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
参考文献
- Wonnacott, S. Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends in Neurosciences. 20 (2), 92-98 (1997).
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
