يركز هذا البروتوكول على استخدام قياس التدفق الخلوي وعد الخرز لتحديد الجراثيم البكتيرية الموسومة ببروميد الإيثيديوم. هذه الطريقة فعالة أيضا لتحليل الاقتران التساهمي للبروتينات على سطح الجراثيم السليمة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحسين تعداد بوغ العصوية الرقيقة وتحليل التسمية في قياس التدفق الخلوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تم بالفعل اقتراح جراثيم Bacillus subtilis لمختلف تطبيقات التكنولوجيا الحيوية والمناعة. ومع ذلك ، هناك حاجة متزايدة لتطوير منهجيات تعمل على تحسين الكشف عن المستضدات التي تجمد على سطح الجراثيم جنبا إلى جنب مع قياسها الكمي. تم اقتراح التحليلات القائمة على قياس التدفق الخلوي سابقا كنهج سريعة وموثوقة ومحددة للكشف عن الخلايا الموسومة من B. subtilis. هنا ، نقترح استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة عرض الجسم المضاد الفلوري (FA) على سطح البوغ وتحديد عدد الجراثيم باستخدام عد الخرز.
لهذا ، استخدمنا بروميد الإيثيديوم كعلامة للحمض النووي وجسم مضاد يحمل علامة allophycocyanin (APC) ، والذي كان مقترنا بالجراثيم ، كعلامة سطحية. تم إجراء القياس الكمي للجراثيم باستخدام عد الخرز لأن هذه التقنية توضح دقة عالية في الكشف عن الخلايا. تم تحليل الجراثيم الموسومة باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، والذي أكد الاقتران. نتيجة لذلك ، ثبت أن وضع العلامات على الحمض النووي يحسن دقة القياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي ، للكشف عن الجراثيم النابتة. ولوحظ أن بروميد الإيثيديوم غير قادر على تسمية الجراثيم الخاملة؛ ومع ذلك ، توفر هذه التقنية تحديدا أكثر دقة لعدد الجراثيم التي تحتوي على بروتين فلوري مقترن بسطحها ، مما يساعد في تطوير الدراسات التي تركز على استخدام الجراثيم كمنصة للتكنولوجيا الحيوية في تطبيقات مختلفة.
المقدمة
Bacillus subtilis هي بكتيريا إيجابية الجرام على شكل قضيب قادرة على إنتاج جراثيم هادئة عندما لا تسمح الظروف البيئية بنمو الخلايا1. الجراثيم هي أشكال خلايا مستقرة للغاية وتستخدم تلك الخاصة بالعديد من الأنواع ، بما في ذلك B. subtilis ، على نطاق واسع كبروبيوتيك للاستخدام البشري والحيواني2. نظرا لمقاومتها وخصائص سلامتها ، تم اقتراح بوغ B. subtilis ، الذي يعرض بروتينات غير متجانسة ، كمساعد مخاطي ، ونظام توصيل لقاح ، ومنصة تثبيت الإنزيم 3,4.
للحصول على جراثيم من B. subtilis ، من الضروري تعريضها للحرمان من ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إعداد قياس التدفق الخلوي
- محاذاة المعلمات البصرية لمقياس التدفق الخلوي المقترن بجهاز كمبيوتر
- قم بتسجيل الدخول إلى برنامج Cytometer.
- من مساحة عمل البرنامج، حدد مقياس الخلايا | ابدأ وانتظر بضع دقائق | الوضع النظيف | اجلس السوائل.
ملاحظة: تمت إزالة فقاعات الهواء والعوائق أثناء عملية بدء مقياس الخلايا، قبل الحصول على العينة.
- مراقبة الجودة
- استخدم كاشف مراقبة الجودة لضبط الفولتية لأنابيب المضاعف الضوئي وتقييم حساسي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في عينات البوغ المعقمة (AS) ، تم الكشف عن 2 × 103 جراثيم / ميكرولتر و 1 × 103 جراثيم / ميكرولتر باستخدام عد الخرز وطريقة بتروف-هوسر ، على التوالي (الشكل 2).
الشكل 1: المخطط العام لقياس الجراثيم. (أ) الجراثيم الموسومة ب EtBr و (ب) الجراثيم ذات التسمية الم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطرق التقليدية ، مثل عد لوحات المستعمرات ، لا تستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل تحتاج أيضا إلى خلايا قابلة للحياة ولا تسمح بقياس كمية الجراثيم المعطلة5. غرفة بتروف-هوسر هي منهجية بديلة ، لكنها تتطلب مجهريا متمرسا لتنفيذها. أثبت قياس التدفق الخلوي أنه بديل مفيد لهذا الغرض.
وصف Genovese et al.12 استخدام قياس التدفق الخلوي للقياس الكمي للخلايا والجراثيم القابلة للحياة من Bacillus sp. باستخدام علامتين للحمض النووي وقدرة تحكم عالية في معدل التدفق .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - قانون المالية 001. Governo do Estado do Amazonas بموارد من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq). يشكر المؤلفون برنامج التطوير التكنولوجي في أدوات الصحة PDTIS-FIOCRUZ على استخدام مرافقه.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| الأجسام المضادة الفلورية المضادة للإنسان | BioLegend | 501410 | APC المضادة للإنسان IL-10 |
| الأجسام المضادة الفلورية المضادة للفأر | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | & nbsp ؛ | التدفق الخلوي | |
| FACSإعداد مقياس الخلوي BD و مجموعة الخرز التتبع (استخدم مع برنامج BD FACSDiva v 6.x) | BD | 642412 | كاشف مراقبة الجودة |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | برنامج |
| الطرد المركزي MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| عد الخرز | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | نيكون | الفلورسنت Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate محلول ملحي | مخزن Sigma-Aldrich | A4503 | |
| أنابيب بلاستيكية دقيقة | أنبوب بوليسترين إيبندورف | ||
| فالكون | 352008 | 5 مل أنبوب بوليسترين ، 12 × 75 مم ، بدون غطاء ، غير معقم |
المراجع
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
