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方法文章

脱细胞苹果来源支架在骨组织工程中的应用 体外 和 体内

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DOI：

10.3791/65226

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2024年2月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Biology, University of Ottawa, 3Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa, 4Department of Surgery, University of Ottawa, 5Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 6Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa, 7SymbioticA, School of Human Sciences, University of Western Australia

本文内容

摘要

在本研究中，我们详细描述了脱细胞化、物理表征、成像以及 体内 植物源性生物材料的植入，以及细胞在支架上的接种与分化方法。所述方法可用于评估植物源性生物材料在骨组织工程中的应用。

摘要

植物来源的 纤维素生物材料已被应用于多种组织工程领域。体内研究表明，来源于天然材料的纤维素支架具有显著的生物相容性。此外，这些支架具有适用于多种组织的结构特征，并能促进哺乳动物细胞的侵入和增殖。最近利用脱细胞化苹果花托组织的研究表明，其孔径大小与松质骨相似， 并能有效支持成骨分化。本研究进一步 探讨了苹果来源纤维素支架在骨组织工程（BTE）应用中的潜力，并评估了其体外和体内的力学性能。将MC3T3-E1前成骨细胞接种于苹果来源的纤维素支架中，随后 评估其成骨潜能及力学性能。碱性磷酸酶和茜素红S染色证实，在成骨诱导培养基中培养的支架中发生了成骨分化。组织学检查显示细胞广泛侵入并出现支架内的矿化现象。扫描电子显微镜（SEM）观察到支架表面存在矿物聚集体， 能量色散X射线光谱（EDS） 进一步确认了磷酸根和钙元素的存在。然而，尽管细胞分化后杨氏模量显著增加，但仍低于健康骨组织的水平。体内研究显示，在大鼠颅骨植入8周后，脱细胞化的苹果来源 支架中出现了细胞浸润及细胞外基质的沉积。此外，将支架从骨缺损处移除所需的力与先前报道的天然颅骨骨折载荷相近。总体而言，本研究证实苹果来源的纤维素是骨组织工程应用中一种具有前景的候选材料。然而，其力学性能与健康骨组织之间的差异可能限制其仅适用于低负荷承载场景。为进一步提升苹果来源纤维素支架在承重应用中的力学性能，可能需要进行额外的结构再设计与优化。

引言

由损伤或疾病引起的大型骨缺损通常需要生物材料移植来实现完全再生1。目前旨在改善骨组织再生的技术通常采用自体、同种异体、异种或合成移植材料2。自体骨移植被认为是修复大型骨缺损的 "金标准"移植方法，其骨组织来源于患者自身。然而，这种移植手术存在多种局限性，包括骨块尺寸与形状受限、组织来源有限以及取骨部位的并发症3。此外，自体移植手术易发生手术部位感染、继发性骨折、取骨或重建部位血肿形成以及术后疼痛4。 骨组织工程 （BTE）为传统骨移植方法提供了一种潜在的替代方案5。该技术结合结构化生物材料与细胞，以构建新的功能性骨组织。在设计用于骨组织工程的生物材料时，关键在于整合大孔结构、促进细胞黏附的表面化学特性以及与天然骨组织相近的力学性能6。以往研究表明，用于骨组织工程的生物材料其理想孔径和弹性模量分别约为100–200 µm7和0.1–20 GPa，具体数值取决于移植部位8。此外，支架的孔隙率及孔间连通性是影响细胞迁移、营养物质扩散和血管生成的关键因素8。

在骨组织工程（BTE）领域，多种已开发和评估的生物材料作为骨移植替代方案展现出良好的应用前景。这些生物材料包括骨诱导性材料、杂化材料以及先进水凝胶8。骨诱导性材料可促进新骨结构的形成。杂化材料由合成和/或天然聚合物组成8。先进水凝胶能够模拟细胞外基质（ECM），并可递送必要的生物活性因子以促进骨组织整合8。羟基磷灰石是一种传统材料，因其组成成分和良好的生物相容性，常被用于BTE9。生物活性玻璃是另一类用于BTE的生物材料，已被证实可刺激特定细胞反应，激活成骨所必需的基因10,11。可生物降解聚合物，如聚乙醇酸（poly(glycolic acid)）和聚乳酸（poly(lactic acid)），也已在BTE中得到广泛应用12。此外，天然或来源于天然的聚合物，如壳聚糖、甲壳素和细菌纤维素，在BTE中也表现出令人鼓舞的效果13。然而，尽管合成与天然聚合物在BTE中均具有潜力，但要构建具有理想宏观结构的功能性支架，通常仍需复杂的制备流程。

相反，天然的宏观纤维素结构可轻松从多种植物中获得，我们研究团队此前已证明，源自植物的纤维素支架适用于不同的组织重建。事实上，经过简单的表面活性剂处理后，我们利用了植物材料的固有结构，突显其作为多功能生物材料的潜力14。此外，这些基于纤维素的支架可用于体外哺乳动物细胞培养应用14，具有良好的生物相容性，并可支持自发的皮下血管化14,15,16,17。我们研究团队及其他研究者均已证实，可根据预期用途从特定植物中获取此类支架14,15,16,17,18,19,20。例如，植物茎和叶中观察到的血管结构与动物组织中的结构表现出显著的相似性19。此外，源自植物的纤维素支架可轻易塑形，并可通过表面生化修饰以获得所需的特性16。在最近的一项研究中，我们在脱细胞过程中加入了盐缓冲液，从而在体外和体内环境中均观察到细胞黏附能力的增强16。在同一项研究中，我们通过在支架表面浇铸水凝胶，证明了植物源性纤维素支架在复合生物材料中的适用性。在近期的研究中，植物源性支架的功能化已被证明可增强其有效性18。例如，Fontana 等（2017年）的研究表明，经RGD涂层处理的脱细胞植物茎可支持人皮肤成纤维细胞的黏附，而未经涂层处理的茎则不具备此能力18。此外，作者还证明，可通过改良的模拟体液对脱细胞植物茎进行人工矿化。在更近的研究中，我们探讨了植物源性纤维素支架中力学敏感性成骨的可行性，并评估了其在 BTE17,20中的潜力。此外，Lee 等（2019年）利用植物源性支架在体外环境中成功培养出类骨组织21。通过对不同植物来源的系统评估，作者发现苹果源性支架最适合人诱导多能干细胞（hiPSCs）的培养与分化。此外，作者 提出，苹果源性支架的结构和力学特性在其适用性中起着关键作用。作为最早应用于组织工程的植物源性支架之一，苹果源性支架已被广泛证实其结构与人类骨组织极为相似，尤其是在孔径为100至200 µm的相互连通孔隙方面14,21。

在本研究中，我们进一步探讨了苹果来源的纤维素支架在骨组织工程中的应用潜力，并对其力学性能进行了分析 体外 和 体内尽管已有关于潜在性的研究 苹果来源支架的 BTE17,20,21，其力学性能尚未得到充分研究。结果表明，MC3T3-E1 前成骨细胞在支架中广泛侵入并发生成骨分化 在分化培养基中培养4周。这些支架的杨氏模量为192.0 ± 16.6 kPa，该值为 显著高于空白支架（未接种细胞的支架）的数值（31.6 ± 4.8 kPa） 接种细胞的支架在培养中 非分化培养基（24.1 ± 8.8 kPa）。然而需要注意的是，健康人骨组织的杨氏模量通常在松质骨中为0.1–2 GPa，皮质骨中约为15–20 GPa8然而，在大鼠颅骨缺损部位植入8周后，细胞接种支架与周围骨组织表现出良好的整合性，推出试验中平均峰值力为113.6 N ± 18.2 N，与既往报道的天然颅骨骨折载荷相近22总体而言，本研究获得的结果在非承重应用方面显示出显著前景。然而，目前苹果来源的纤维素支架尚不具备与植入部位周围骨组织精确匹配所需的力学性能。因此，仍需进一步开发以充分发挥这些支架的潜力。

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方案

实验方案已通过渥太华大学动物护理委员会的审查和批准。

1. 支架制备

  1. 使用切片机将麦克金托什苹果（Canada Fancy）切成8 mm厚的片状，并将苹果片的花托组织切成5 mm × 5 mm的方块。
  2. 将方形样品置于0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）中处理2天。
  3. 用去离子水清洗脱细胞样品，并在100 mM CaCl2 中室温（RT）孵育过夜，以去除残留的表面活性剂。
  4. 将样品（即支架）在70%乙醇中灭菌30分钟，用去离子水洗涤后，置于24孔细胞培养板中，待接种细胞。

2. 细胞培养与支架接种

  1. 在细胞培养条件（37°C，95% 空气和 5% CO2 的湿润环境）下，将 MC3T3-E1 Subclone 4 细胞培养于直径为 10 cm 的细胞培养处理培养皿中。
  2. 制备细胞培养基，成分为添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 Eagle 最低必需培养基-α 改良型 （α-MEM）。
  3. 当细胞融合度达到 80% 时，使用胰蛋白酶消化法（0.05% 胰蛋白酶-EDTA）将细胞从培养皿上解离。
  4. 将细胞悬液在约 200 × g 条件下离心 3 分钟，吸除上清液，并将细胞重悬于 α-MEM 中，浓度为每毫升 2.5 × 107 个细胞。
  5. 取 40 µL 细胞悬液滴加至支架表面，在细胞培养条件下孵育 1 小时使细胞贴附；随后，在培养板的每个培养孔中加入 2 mL 培养基 。
  6. 每 2–3 天更换一次培养基，持续 14 天。
  7. 在前述细胞培养基中添加 50 µg/mL 抗坏血酸和 4 mM 磷酸钠，制备成诱导分化培养基。
  8. 将支架置于诱导分化培养基中孵育 4 周，以诱导 MC3T3-E1 细胞分化，每 3–4 天更换一次培养基。同时，将另一组支架置于未添加分化诱导成分的普通培养基 （即非诱导分化培养基）中，在相同时间内按照相同的换液频率进行孵育，作为阴性对照 。

3. 使用共聚焦激光扫描显微镜测量孔径大小

  1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗脱细胞苹果来源的支架。
  2. 将支架置于1 mL 10%（v/v）荧光增白剂Calcofluor White染液中，室温避光孵育25分钟。
  3. 用PBS清洗 支架 （n = 3），并在每个支架上随机选择三个区域，使用高速共振共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）以10倍放大倍数和DAPI通道进行成像，具体设置如下：
    1. 激光发射滤光片配置：405 nm（激光）；425–475 nm （发射）
    2. 手动调节激光功率和探测器，以确保最佳图像采集效果。采集20层z轴堆栈图像，步长为5 µm。
  4. 使用ImageJ软件对共聚焦图像进行处理和分析，步骤如下：
    1. 使用 “Z轴投影至最大强度” 功能生成图像，并应用“查找边缘”功能以突出孔隙边缘。
    2. 使用“自由手选择”工具手动勾勒孔隙轮廓。
    3. 将每个孔隙拟合为椭圆，测量其长轴长度，汇总所有测量值（本研究共54个——每个支架3个随机区域，每个区域6个孔隙），并计算平均长度。

4. 使用共聚焦激光扫描显微镜进行细胞分布分析

  1. 用 PBS 将在非分化或分化培养基中培养的接种细胞支架洗涤三次。用 4% 多聚甲醛固定支架 10 分钟。
  2. 用去离子水彻底洗涤每个支架，用 Triton-X 100 溶液对细胞进行通透处理 5 分钟，再用 PBS 再次洗涤。
  3. 将支架在 1 mL 1% 高碘酸溶液中孵育 40 分钟，并用去离子水冲洗14,16。
  4. 将支架置于 1 mL 含有 100 mM 焦亚硫酸钠和 0.15 M 盐酸并添加 100 µg/mL 碘化丙啶的溶液中孵育。确保支架完全浸没于该溶液中。
  5. 用 PBS 洗涤支架，并在避光条件下将支架在 5 mg/mL DAPI 溶液中孵育 10 分钟以染色细胞核。再次彻底洗涤，并将支架保存于 PBS 中待成像。
  6. 使用高速共振式共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），在 10 倍放大倍数下，随机选取三个不同接种细胞支架的三个表面进行成像，采用 DAPI 和 TRITC 通道，具体设置如下：
    1. 激光发射滤光片配置：
      DAPI：激光：405 nm；发射：425–475 nm
      ​TRITC：激光：561 nm；发射：570–620 nm
    2. 手动调节激光功率和探测器，以确保最佳图像采集效果。采集 z 轴方向共 20 张图像的 z-stack，步长为 5 µm。
  7. 使用 ImageJ 软件处理共聚焦图像，并利用 Z-Project to Maximum Intensity 功能生成 z 轴最大强度投影，用于图像分析 。

5. 碱性磷酸酶分析

  1. 用 PBS 将在非分化或分化培养基中培养的接种细胞支架洗涤三次。用 10% 中性缓冲福尔马林固定支架 30 分钟。同时固定空白支架（未接种细胞的支架）作为阴性对照。
  2. 将一片 5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸盐/硝基蓝四唑盐（BCIP/NBT）试剂片溶解于 10 mL 去离子水中，配制 BCIP/NBT 染色液。
  3. 用 0.05% Tween 溶液洗涤固定后的支架，然后在室温下用 BCIP/NBT 溶液染色 20 分钟。再次用 0.05% Tween 溶液洗涤染色后的支架，并将其保存在 PBS 中，待成像前使用。
  4. 使用 1200 万像素数码相机对染色后的支架进行成像。

6. 钙沉积分析

  1. 用 PBS 将在非分化或分化培养基中培养的接种细胞支架洗涤三次。用 10% 中性缓冲福尔马林固定支架 30 分钟。同时固定空白支架（未接种细胞的支架）作为阴性对照。
  2. 配制 2% (w/v) 的茜素红 S (ARS) 染色液。
  3. 用去离子水洗涤固定后的支架，加入 ARS 染色液在室温下染色 1 小时。染色后用去离子水洗涤支架，并在成像前保存于 PBS 中。
  4. 使用 1200 万像素数码相机对染色后的支架进行成像。

7. 矿化分析

  1. 用 PBS 将在非分化或分化培养基中培养的接种细胞支架洗涤三次。用 4% 多聚甲醛固定支架 48 小时。同时固定空白支架（未接种细胞的支架） 作为阴性对照。
  2. 按照先前所述方法23，将样品依次浸入浓度从 50% 逐步增加至 100% 的乙醇溶液中进行脱水处理。
  3. 采用扫描电子显微镜（SEM）和能谱分析（EDS）对矿化沉积物进行如下分析：
    1. 按照制造商的操作说明24，使用临界点干燥仪对样品进行干燥。
    2. 按照制造商的操作说明25，使用金溅射镀膜仪在支架表面镀上一层 5 nm 厚的金膜。
    3. 使用扫描电子显微镜，在 3 kV 电压和 85 倍放大倍数下对支架表面进行成像。
    4. 将扫描电子显微镜设定在 15 kV 电压下进行 EDS 分析。在每个支架上随机选取三个区域，采集 EDS 谱图以分析矿化沉积物的成分。

8. 杨氏模量测量

  1. 将接种细胞的支架从相应的培养液中取出，并立即对样品进行测试。
  2. 使用配备1.5 N力传感器的自制单轴压缩装置，以3 mm·min-1的恒定速率对支架（每组条件n = 3）进行压缩，直至达到支架高度10%的最大压缩应变。
  3. 根据应力-应变曲线线性部分的斜率确定杨氏模量。在本研究中，模量的测定范围为9%至10%的应变区间。

9. 组织学分析细胞浸润和矿化：体外支架

  1. 用 PBS 将接种细胞并在非分化或分化培养基中培养的支架冲洗三次。
  2. 将接种细胞的支架用4%多聚甲醛固定48小时，然后在70%乙醇中重悬保存。
  3. 组织学：
    注意：在本研究中，整个 后续步骤中所述的组织学制备（包埋、切片和染色）由渥太华大学Louise Pelletier组织学核心设施完成。
    1. 脱水并包埋于石蜡后，从支架内部1 mm处开始，将样品切成5-µm厚的连续切片，并将切片贴附于载玻片上。
    2. 用苏木精和伊红（H&E）对切片进行染色&E）或冯库萨（von Kossa，VK）染色。
    3. 使用切片扫描显微镜对切片进行成像 40倍放大 （n = 1 个支架） 非分化培养基（n = 2个支架）和分化培养基（n = 2个支架）在本研究中
    4. 使用 ImageJ 软件，通过视觉评估细胞浸润（H&E 染色）和矿化（VK 染色）。

10. 大鼠颅骨缺损模型

  1. 获得当地动物护理委员会审查并批准的实验方案。
  2. 按照上述第1节所述方法，使用5 mm活检打孔器制备圆形（直径5 mm，厚度1 mm）去细胞支架。
  3. 按照既定方案26进行双侧开颅手术，步骤如下：
    1. 使用异氟烷对雄性Sprague-Dawley大鼠进行麻醉，初始浓度为3%，直至大鼠失去意识，之后在手术过程中维持在2-3%。
    2. 使用手术刀片切开覆盖的皮肤，暴露骨膜和颅骨，随后去除骨膜。
    3. 使用配备直径5 mm环钻的牙科钻，在矢状缝两侧的顶骨上制造双侧骨缺损，同时持续用0.9% NaCl进行冲洗。
    4. 用0.9% NaCl清洗周围骨组织，清除所有骨碎片。
    5. 将圆形去细胞支架植入骨缺损处。
    6. 使用4-0缝线缝合覆盖的皮肤。
  4. 术后大鼠自由进食饮水，并每日进行观察监测。
  5. 植入后8周，通过CO2吸入并辅以胸腔穿刺作为二次安乐死措施处死大鼠。
  6. 为暴露颅骨并取出植入物，使用手术刀片去除覆盖颅骨的皮肤。
  7. 使用牙科钻在额骨和枕骨以及双侧顶骨侧面进行切割，完全移除颅骨顶部。

11. 推出试验

  1. 将单轴压缩装置（配备 445 N 负载传感器）连接到 USB 数据采集模块。
  2. 将数据采集模块连接至装有数据采集软件的计算机。
  3. 颅骨取出后，立即将每个 样本 （本研究中来自 4 只动物的 7 个植入物）放置在单轴压缩装置的样品支架上，使骨的背侧朝上。
  4. 以 0.5 mm/min 的速度降低冲头，直至轻微接触取出的植入物。
  5. 通过数据采集软件以 0.5 mm/min 的恒定速度降低冲头，使冲头穿过植入物直至完全推出，从而启动测试。
  6. 使用数据采集软件记录力-位移曲线上的峰值力。

12. 组织学分析细胞浸润和矿化： 体内 支架

  1. 将提取的颅骨和植入物置于10%中性缓冲福尔马林中固定72小时，随后重悬于70%乙醇中保存。
  2. 组织学：
    注意：在本研究中，后续步骤中描述的所有组织学处理（包埋、切片和染色）均由Accel Labs（加拿大魁北克省蒙特利尔市）完成。
    1. 将样品（包埋于甲基丙烯酸甲酯中）在三个不同层面（顶部、底部及接近中心处）切成6 µm厚的切片，并贴附于显微镜载玻片上。
    2. 使用H&E染色或Masson-Goldner三色染色（MGT）对切片进行染色。
  3. 使用载玻片扫描显微镜以40倍放大倍数对切片进行成像（本研究中包含来自2只动物的4个移植物样本）。
  4. 利用ImageJ软件，通过视觉评估细胞浸润情况（H&E染色）和胶原沉积情况（MGT染色）。

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结果

孔径测量、细胞分布和 体外 矿化图1 和 图2)
经SDS和CaCl处理后，实现了苹果组织支架中天然细胞成分的完全去除2 (图1A）。支架呈现出高度多孔的结构，经共聚焦显微镜确认。图像定量分析显示平均孔径为 154 µm ± 40 µm孔径分布范围在 73 µm 和 288 µm然而，大多数孔径范围在 100 µm 和 200 µm (图1C).

在分化培养基中培养4周后，接种细胞的支架显示出广泛的白色矿物质沉积（图1A）。含有细胞的支架呈现不透明的白色，提示发生了矿化，而空白支架（未接种细胞的支架）则未观察到此现象。此外，共聚焦激光扫描显微镜分析显示，细胞在支架内呈均匀分布（

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讨论

若干 体外 和 体内 研究表明，植物来源的纤维素具有良好的生物相容性，并在组织工程中具有应用潜力14,15,16,18,19,20，更具体地说，用于支持成骨分化20,21本研究的目的是进一步探讨苹果来源的纤维素支架在骨组织工程（BTE）中的潜力，并评估这些支架的力学性能 体外 和 体内.

对于 体外 研究中，在去除苹果组织中的天然细胞后，将前成骨细胞（MC3T3-E1）接种于支...

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披露

利益冲突声明：M.L.L、M.T、R.J.H.、C.M.C.、I.C. 和 A.P. 是由渥太华大学和 Spiderwort 公司提交的专利申请的发明人，这些专利申请涉及植物来源的纤维素在骨组织工程（BTE）中的应用。 M.L.L.、R.J.H.、C.M.C. 和 A.P. 在 Spiderwort 公司拥有经济利益。

致谢

本项目获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）（发现基金）和李嘉诚基金会的资助。M.L.L. 获得了安大略省卓越中心TalentEdge项目的支持，R.J.H. 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会研究生奖学金和安大略省研究生奖学金（OGS）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚ThermoFisherD1306DAPI
茜素红 SSigma-AldrichA5533ARS
抗坏血酸Sigma-AldrichA4403细胞培养
氯化钙ThermoFisherAA12316CaCl2
卡乐氟白Sigma-Aldrich18909
牙科钻头手术工具
乙醇ThermoFisher615095000
胎牛血清Hyclone LaboratoriesSH30396FBS
福尔马林Sigma-AldrichHT50112810% 福尔马林
戈德纳三色染色液Sigma-Aldrich1.00485GTC
苏木精-伊红染色液Fisher ScientificNC1470670H&E
高速共振共聚焦激光扫描显微镜NikonNikon Ti-E A1-R
盐酸Sigma-Aldrich258148
ImageJ 软件美国国立卫生研究院
灌洗用生理盐水BaxterJF71230.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 细胞ATCCCRL-2593前成骨细胞
麦克金托什苹果加拿大特级品
甲基丙烯酸甲酯Sigma-AldrichM55909组织学包埋
最低必需培养基ThermoFisherM0894α-MEM
多聚甲醛Fisher ScientificO40424%；PFA
青霉素/链霉素Hyclone LaboratoriesSV30010细胞培养
过碘酸Sigma-Aldrich375810
磷酸盐缓冲液Hyclone Laboratories2810305PBS；不含 Ca2+ 和 Mg2+
碘化丙啶Invitrogenp3566
扫描电子显微镜JEOLJSM-7500F FESEMSEM 和 EDS
切片扫描显微镜ZeissAXIOVERT 40 CFL
十二烷基硫酸钠Fisher ScientificBP166SDS
亚硫酸氢钠Sigma-Aldrich31448
磷酸钠ThermoFisherBP329
Sprague-Dawley 大鼠Charles-River Laboratories400雄性
缝合线EthiconJ494G4-0
环钻ACE Surgical Supply Co583-01825 mm 直径
曲拉通 X-100ThermoFisher807423
胰蛋白酶Hyclone LaboratoriesSH30236.02细胞培养
吐温Fisher ScientificBP337
通用压缩装置CellScaleUniVert
冯科萨染色Sigma-Aldrich1.00362组织学

参考文献

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