Trichoderma stromaticum 分生孢子在人外周血单核细胞来源巨噬细胞内的活性检测

摘要

巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估针对真菌的免疫应答调控的研究。本文旨在介绍一种方法，用于评估经Trichoderma stromaticum分生孢子刺激后，人外周血单个核细胞来源的巨噬细胞的吞噬与清除能力。

摘要

巨噬细胞代表了抵御病原体的重要防线，负责防止病原体在不同组织中的生长和定植。分生孢子的吞噬作用是一个关键过程，可用于研究巨噬细胞与病原体相互作用中涉及的胞质和分子事件，并确定被吞噬分生孢子的死亡时间。利用巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估针对真菌的免疫应答调节的研究。逃避吞噬作用以及从吞噬体中逃逸是真菌毒力的机制。本文报道了可用于分析T. stromaticum分生孢子的吞噬、清除及活力的方法，T. stromaticum是一种用作生物防治和生物肥料的真菌，同时也具有引起人类感染的能力。该实验方案包括：1）Trichoderma的培养；2）洗涤以获得分生孢子；3）采用多蔗糖溶液法分离外周血单个核细胞（PBMCs），并将其分化为巨噬细胞；4）使用圆形玻璃盖玻片和染色法进行体外吞噬实验；5）在分生孢子被吞噬后，通过清除实验评估其活力。总之，这些技术可用于测量巨噬细胞对真菌的 清除效率。

引言

该 Trichoderma 属（目：肉座菌目，科：肉座菌科）) 由普遍存在的腐生真菌组成，这些真菌寄生于其他真菌物种，并能够产生一系列具有商业价值的酶¹这些真菌物种被用于异源蛋白的生产²，纤维素的生产³乙醇、啤酒、葡萄酒和纸张⁴，纺织工业中⁵，食品工业⁶，以及在农业中作为生物防治剂^7,8除了这些真菌物种在工业上的应用价值外，其对人类感染数量的不断增加也引起了一些关注 Trichoderma 机会性病原体的物种状态⁹.

Trichoderma 属真菌在培养中生长迅速，菌落初期呈白色棉絮状，随后逐渐变为黄绿色至深绿色¹⁰。它们能够适应广泛的 pH 和温度条件，其中机会性致病物种可在生理 pH 和体温条件下存活，从而定植于人体多种组织^11,

方案

伦理考量与人体受试者
本研究中涉及人类的所有实验均按照《赫尔辛基宣言》及巴西联邦法律进行，并已获得圣克鲁斯州立大学伦理委员会批准（项目识别编号：550.382/ 2014）。

采集自巴西巴伊亚州伊尔埃乌斯市未接触过所研究真菌相关职业活动的健康志愿者的人类外周血。排除有已知健康疾病或正在服药的个体。所有受试者均自愿同意参与，并在纳入本研究前签署知情同意书。

1. 试剂与溶液的准备

注意：在开始之前，请准备好以下试剂和溶液。有关试剂和材料供应商的信息，请参见材料表（TOM）。

1. 制备1×平衡无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
   注意：本实验方案中未使用无内毒素的PBS。
2. 制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，每皿倒入20 mL，用于T. stromaticum的培养。每个供体准备六块PDA平板，每种条件使用一块平板：3 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h。此外，每组对照各使用三块平板：三块用于Trichoderma对照，三块用于R10培养基对照。建议使用60 mm × 15 mm或100 mm × 15 mm的培养皿，以获得最佳分生孢子回收效果。

结果

巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估针对真菌的免疫应答调控的研究。我们采用了巨噬细胞对分生孢子的吞噬作用 T. stromaticum 分生孢子以评估分生孢子在被吞噬后的存活能力，因为逃逸吞噬作用和吞噬体逃逸是真菌毒力的机制。研究人员在研究具有临床意义的真菌物种时，应将这些技术作为首批检测方法之一来实施。

图2：吞噬作用 T. stromaticum 人外周血单核细胞来源的巨噬细胞对分生孢子的吞噬作用 吞噬作用动力学的代表性结果A

讨论

对于包括Aspergillus fumigatus、Cryptococcus、Candida albicans 在内的多种真菌病原体而言，分生孢子或酵母细胞的吞噬作用是研究巨噬细胞与病原体相互作用过程中胞质及分子事件的关键过程，同时也可用于确定被吞噬分生孢子的死亡时间^14,39,40。吞噬作用也是Trichoderma与宿主相互作用中的关键过程。 Trichoderma属可调控多种吞噬通路，包括Dectin-1和Dectin-2、Toll样受体2和Toll样受体4、MHC以及NF-κB^{25,28,41,.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	康宁	CLS431470	15 mL 离心管，聚丙烯材质，锥底带盖，单独无菌包装
24孔平底细胞培养板	卡斯维	K12-024	由聚苯乙烯制成，带有字母数字标识；细胞培养板无DNase、无RNase、无热原，并且不含细胞毒性物质；经γ射线灭菌。
细胞培养 CO2 培养箱	Sanyo	303082	CO2培养箱用于创建并控制类似于人体内部的环境，从而支持不同类型细胞的体外生长与增殖。
1.5 mL 离心管（Eppendorf 类型）	卡普	5101500	由聚丙烯制成，管盖与管体相连，可单手开合。内壁经过抛光处理，减少蛋白质吸附，便于观察样品，且无DNase、RNase和内毒素。
圆形盖玻片 15 mm	Olen	K5-0015	圆形盖玻片用于细胞培养中的显微镜技术。由超透明透光玻璃制成，厚度为0.13 mm
II级B2型（全排式）生物安全柜	Esco Lifesciences 集团	2010274	Airstream II级B2型生物安全柜（AB2）可提供产品、操作者及环境的防护，适用于处理微量有毒化学品以及生物安全等级为I级、II级或III级的生物因子。在II级B2型生物安全柜中，所有流入和垂直下降气流均经过高效（HEPA）或超高效（ULPA）过滤后，直接排至外部环境，不在工作表面区域循环。
葡萄糖马铃薯琼脂培养基	默克	145	马铃薯葡萄糖琼脂用于酵母菌和真菌的培养与计数
EDTA真空采血管	第一实验室	FL5-1109L	EDTA 是血液学常规检查推荐的抗凝剂，因为它是保存细胞形态的最佳抗凝剂。
Entellan	默克	1.07961	固定剂；Entellan 是一种无水封片介质，用于显微镜观察的永久封片。
胎牛血清	Gibco	A2720801	胎牛血清（FBS）是一种 细胞和组织培养基的通用生长添加剂。FBS 是一种天然混合物，含有细胞贴附、生长和增殖所需的大多数组分，对大多数类型的人源和动物源细胞（包括昆虫细胞）均有效。
Flaticon			图像数据库
甘油	默克	24900988	冷冻保护剂甘油用于细胞和孢子的冷冻
Histopaque-1077			聚蔗糖溶液
Image J			图像分析软件
显微镜载玻片	精确度	7105	显微镜载玻片 26 x 76 mm，磨砂边缘，厚度 1.0 至 1.2 mm。采用特殊光学玻璃制成，每片之间用丝绸纸隔开包装，具有高透明度，无任何缺陷
小型离心机	Prism	C1801	Prism Mini 离心机设计极为紧凑，占地面积极小。配备两个可互换的快速释放转子，最高转速可达 6000 rpm。电子刹车系统可实现快速减速，自动开启的顶盖便于样品取放，减少操作时间。
血细胞计数板	卡斯维	K5-0011	Neubauer 计数室用于计数细胞或其他悬浮颗粒。
全景快速	Laborclin	620529	Laborclin的  panoptic fast c 是一种用于血液学快速染色的试剂盒
青霉素/链霉素溶液 - 10,000U	LGC 生物技术	BR3011001	使用抗生素以避免在超净工作台外操作时可能引起的污染。
直径90毫米 × 高15毫米 平底培养皿	Cralplast	18248	一次性培养皿；由高透明度聚苯乙烯（PS）制成；平底；表面光滑；规格：90 × 15 mm。
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	10010001	PBS 是一种以水为基础的盐溶液，成分简单。它对大多数细胞具有等渗性和无毒性。包含氯化钠和磷酸盐缓冲液，其配方旨在防止渗透压休克的同时维持活细胞的水分平衡。
巴斯德吸管 3 mL 无菌	Accumax	AP-3-B-S	无菌ACCUMAX帕斯德3 mL移液管，容量3 mL，由透明低密度聚乙烯（LDPE）制成，单独无菌包装
冷藏离心机	赛默飞世尔科技	TS-HM16R	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R 制冷离心机是一款带有用户友好控制面板的制冷离心机，可轻松预设转速、RCF 值、运行时间 温度和运行程序。Megafuge 16R 可达到的最高转速为 15,200 转/分钟，最大相对离心力为 25,830 × g。
RPMI-1640培养基	默克	MFCD00217820	HEPES 改良型，含 L-谷氨酰胺和 25 mM HEPES，不含碳酸氢钠，粉末状，适用于细胞培养
单通道微量移液器	Eppendorf	Z683809	单通道微量移液器用于精确转移和测量极小体积的液体。
移液器使用技巧	康宁	4894	容量为10 µL 和 1,000 µL 可高压灭菌
三目倒置显微镜	LABOMED	VU-7125500	它使您能够在不打开试管和瓶子的情况下观察内部细胞，从而避免污染问题。