대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 본 논문의 목적은 Trichoderma stromaticum conidia로 자극된 인간 말초혈액 단핵 유래 대식세포의 식균작용 및 제거 능력을 평가하는 방법을 제시하는 것이다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages의 생존력 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
대식세포는 중요한 방어선을 나타내며 다른 조직에서 병원체의 성장과 집락화를 방지하는 역할을 합니다. 분쇄자 식균작용은 대식세포-병원체 상호 작용과 관련된 세포질 및 분자 사건을 조사하고 내재화된 분생포자의 사망 시간을 결정할 수 있는 핵심 과정입니다. 대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 식세포작용(phagocytosis)의 회피와 식세포(phagosome)의 탈출은 곰팡이 독성의 기전입니다. 여기에서는 생물 방제 및 생물 비료로 사용되며 인간 감염을 유도할 수 있는 곰팡이인 T. stromaticum conidia의 식균작용, 제거 및 생존력 분석에 사용할 수 있는 방법을 보고합니다. 프로토콜은 1) Trichoderma 배양, 2) 분생포자를 얻기 위한 세척, 3) 다자당 용액법을 사용한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리 및 PBMC를 대식세포로 분화, 4) 둥근 유리 커버슬립 및 착색을 사용한 시험관 내 식세포작용 방법, 5) 분생포자 식균작용 후 분생포자 생존력을 평가하기 위한 클리어런스 분석으로 구성됩니다. 요약하면, 이러한 기술은 대식세포의 곰팡이 제거 효율을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
Trichoderma 속(목: Hypocreales, 과: Hypocreaceae)은 다른 곰팡이 종의 기생충인 유비쿼터스 부생균으로 구성되어 있으며 상업적으로 유용한 다양한 효소를 생산할 수 있습니다1. 이들 곰팡이 종은 이종 단백질2의생산, 셀룰로오스3, 에탄올, 맥주, 와인, 종이4의 생산, 섬유산업5, 식품산업6, 농업에서 생물학적 방제제7,8의 생산에 사용된다. 이러한 곰팡이 종에 대한 산업적 관심과 더불어, 인간의 감염 건수가 증가함에 따라 일부 Trichoderma 종은 기회주의적 병원체의 지위를 부여받았다9.
Trichoderma spp.는 배양에서 빠르게 성장하며, 처음에는 흰색과 솜털 같은 군체가 녹색을 띤 노란색에서 짙은 녹색으로 변한다
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
윤리적 고려 사항 및 인간 주제
이 연구에서 기술된 인간을 대상으로 한 모든 실험은 헬싱키 선언 및 브라질 연방법에 따라 수행되었으며 산타크루즈 주립대학교 윤리위원회(프로젝트 식별 코드: 550.382/2014)의 승인을 받았습니다.
인간 말초 혈액은 연구된 곰팡이와 관련된 직업 활동에 노출되지 않은 브라질 바이아(Bahia)의 일레우스(Ilhéus) 시의 건강한 지원자로부터 수집되었습니다. 보고된 건강 상태가 있거나 약물을 사용하는 개인은 제외되었습니다. 모든 피험자는 이 연구에 포함되기 전에 자발적으로 참여에 동의하고 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다.
1. 시약 및 용액의 준비
알림: 계속하기 전에 다음 시약과 용액을 준비하십시오. 시약 및 재료 공급업체 정보는 재료 표 (TOM)를 참조하십시오.
- 균형 잡힌 멸균 인산염 완충 식염수 1x(PBS)를 준비합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 내독소가 없는 PBS가 사용되지 않았습니다. - 감자 포도당 한천(PDA) 배지를 준비하고 T. stromaticu....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 식세포작용(phagocytosis)의 회피와 식세포(phagosome)의 탈출이 진균 독성의 기전이기 때문에 식세포작용(phagocytosis) 후 분생포자의 생존력을 평가하기 위해 T. stromaticum conidia의 식세포작용(phagocytosis)을 사용했다. 연구자들은 임상적 관심 종을 조사할 때 첫 번째 분석 중 하나로 이러한 기술을 수행해야 합니다.
그림 2: 인간 말초 혈액 단핵 유래 대식세포에 의한 T. stromatic.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 크립토코커스(Cryptococcus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 등을 포함한 여러 진균 병원체의 경우, 분추형 또는 효모 식균작용은 대식세포-병원체 상호작용에서 세포질 및 분자 사건을 조사하고 내재화된 분생포자의 사망 시간을 결정할 수 있는 핵심 과정입니다 14,39,40. 식세포작용(phagocytosis)은 Trichoderma-host 상호작용의 핵심 과정입니다. Trichoderma 속은 Dectin-1 및 Dectin-2, Toll-like receptor 2 및 Toll-like receptor 4, MHC 및 NF-κB 25,28,41,42.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 RED0011/2012 및 RED008/2014 보조금을 받은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia(FAPESB)와 같은 브라질 금융 기관의 지원을 받았습니다. U.R.S., J.O.C. 및 M.E.S.M.은 각각 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES) 및 FAPESB에서 수여하는 장학금을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 원심분리기 튜브 | Corning | CLS431470 15 mL 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 뚜껑이 있는 원뿔형 바닥, 개별 멸균 | |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | 영숫자 식별이 가능한 폴리스티렌으로 제작; 세포 배양 플레이트는 DNase, RNase 및 발열원이 없으며 세포 독성 물질이 없습니다. 감마선에 의해 살균됩니다. |
| 세포 배양 CO2 인큐베이터 | Sanyo | 303082 | CO2 인큐베이터는 인체와 유사한 조건을 만들고 제어하는 역할을 하므로 다양한 세포 유형의 체외 성장 및 증식을 가능하게 합니다. |
| Centrifuge Microtube(eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | 폴리프로필렌으로 제작되었으며, 튜브에 캡이 부착되어 있어 한 손으로도 열고 닫을 수 있습니다. 내부는 단백질 접착에 대해 광택이 나고 시료 가시성을 위해 DNase, RNase 및 발열원이 없습니다 |
| 원형 커버슬립 15mm | Olen | K5-0015 | 원형 커버슬립은 세포 배양의 현미경 기술에 사용됩니다. 매우 투명한 반투명 유리로 제작되었습니다. 0.13 mm |
| 클래스 II 유형 B2 (총 배기) 생물 안전 캐비닛 | Esco Lifesciences 그룹 | 2010274 | Airstream Class II 유형 B2 생물 안전 캐비닛 (AB2)은 제품, 작업자 및 환경 보호를 제공하며 생물학적 안전성 수준 I, II 또는 III에 할당 된 미량의 독성 화학 물질 및 제제 작업에 적합합니다. 클래스 II 유형 B2 캐비닛에서 모든 유입 및 하향 흐름 공기는 HEPA/ULPA 여과 후 작업 표면을 가로질러 재순환되지 않고 외부 환경으로 배출됩니다. |
| 포도당 감자 한천 매체 | Merck | 145 | 감자 포도당 한천은 효모 및 곰팡이 |
| EDTA 진공 채혈 튜브 | FirstLab | FL5-1109L | EDTA는 세포 형태를 보존하기 위한 최고의 항응고제이므로 혈액학 루틴에 권장되는 항응고제입니다. |
| 엔텔란 | 머크 | 1.07961 | 고정제; Entellan은 현미경 검사를 위한 영구 장착을 위한 무수 장착 매체입니다. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS)은 a 세포 및 조직 배양 배지의 보편적 인 성장 보충제. FBS는 세포 부착, 성장 및 증식에 필요한 대부분의 요인의 천연 칵테일로, 대부분의 인간 및 동물(곤충 포함) 세포에 효과적입니다. |
| 플랫콘 | 이미지 데이터베이스 | ||
| 글리세롤 | Merck | 24900988 | 동결 보호제 글리세롤은 세포와 포자를 동결하는 데 사용됩니다. |
| Histopaque-1077 | 폴리자당 용액 | ||
| 이미지 J | 이미지 분석 소프트웨어 | ||
| 현미경 슬라이드 | 정밀 | 7105 | 현미경 검사용 슬라이드 26 x 76mm 무광택 랩 두께 1.0 - 1.2mm. 특수 광학 유리로 제작되었으며 결함이 없는 고품질 투명도의 실크 종이 칸막이로 포장 |
| 미니 원심분리기 | 프리즘 | C1801 | Prism Mini 원심분리기는 매우 작은 설치 공간으로 매우 컴팩트하게 설계되었습니다. 최대 6000rpm까지 회전하는 교체 가능한 퀵 릴리스 로터 2개가 포함되어 있습니다. 전자식 브레이크는 빠른 감속을 제공하고 자동 개방 뚜껑을 통해 시료에 쉽게 접근할 수 있어 처리 시간이 단축됩니다. |
| Neubauer 챔버 | Kasvi | K5-0011 | Neubauer Counting Chamber는 세포 또는 기타 부유 입자를 계수하는 데 사용됩니다. |
| 파놉틱 빠르다 | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c는 혈액학에서 빠른 염색을 위한 키트입니다 |
| 페니실린/스트렙토마이신 용액 - 10,000U | LGC- 생명공학 | BR3011001 | 항생제는 층류 외부의 조작에 의한 오염 가능성을 피하기 위해 사용됩니다. |
| 페트리 접시 90 x 15 mm 부드러운 | Cralplast | 18248 | 일회용 페트리 접시; 투명도가 높은 폴리스티렌(PS)으로 제작되었습니다. 평평한 바닥; 매끄러운; 크기: 90 x 15mm. |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 PBS는 간단한 제형의 수성 식염수입니다. 그것은 등장성이며 대부분의 세포에 독성이 없습니다. 여기에는 염화나트륨과 인산염 완충액이 포함되어 있으며 살아있는 세포의 수분 균형을 유지하면서 삼투압 쇼크를 방지하도록 제조되었습니다. | |
| 파스퇴르 3 mL 멸균 | Accumax | AP-3-B-S | 멸균 ACCUMAX 파스퇴르 3 ML 피펫, 투명 저밀도 폴리에틸렌(LDPE) 및 개별 멸균 |
| 냉장 원심분리기 | Thermo Scientific | TS-HM16R | Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R 냉장 원심분리기는 사용자 친화적인 제어판을 갖춘 냉장 원심분리기로 속도, RCF 값, 러닝타임, 온도 및 실행 프로필. Megafuge 16R은 최대 속도에 도달할 수 있습니다. 15,200RPM 및 최대 RCF 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, L-glutamine, 25 mM HEPES 포함, 중탄산나트륨 없음, 분말, 세포 배양에 적합 |
| 단일 채널 마이크로피펫 | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes는 매우 적은 양의 액체를 정확하게 전달하고 측정하는 데 사용됩니다. |
| Micropipettor | Corning | 4894 | 용량 10 µ L 및 1,000 &마이크로; L 오토클레이브 가능 |
| 삼안 도립 현미경 | LABOMED | VU-7125500 | 튜브와 병을 열지 않고도 내부의 세포를 관찰할 수 있으므로 오염 문제를 방지할 수 있습니다. |
참고문헌
- Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
- Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrell....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
