小鼠常母离 体 肝机灌注

Summary

为小鼠肝脏创建了常温 离体 肝灌注（NEVLP）系统。该系统需要显微外科手术经验，但允许可重复的灌注结果。利用小鼠肝脏的能力有助于研究分子途径以鉴定新型灌注添加剂，并能够执行专注于器官修复的实验。

Abstract

该协议提出了使用小鼠肝脏的优化的无红细胞NEVLP系统。小鼠肝脏的 离 体保存是通过采用改良的插管和改编自传统商业 离体 灌注设备的技术来实现的。该系统用于评估灌注12 h后的保存结果。C57BL / 6J小鼠作为肝脏供体，通过插管门静脉（PV）和胆管（BD）排出肝脏，随后用温（37°C）肝素化盐水冲洗器官。然后，将移出的肝脏转移到灌注室并进行常温氧合机灌注（NEVLP）。每隔3小时收集入口和出口灌注液样品进行灌注分析。灌注完成后，获得肝脏样本进行组织学分析，并通过苏木精 - 伊红（HE）染色使用改良的铃木评分评估形态完整性。优化实验得出以下结果:（1）体重超过30g的小鼠由于其胆管（BD）的尺寸较大，被认为更适合实验。（2） 与聚丙烯插管相比，2 Fr（外径 = 0.66 mm）聚氨酯插管更适合插管门静脉 （PV）。这归因于聚氨酯材料增强了抓地力，从而减少了从身体转移到器官室过程中导管打滑。（3）对于胆管（BD）的插管，发现1Fr（外径= 0.33mm）聚氨酯套管比聚丙烯UT-03（外径= 0.30mm）套管更有效。通过这种优化的方案，小鼠肝脏成功保存了12小时，对组织学结构没有显着影响。苏木精-伊红 （HE） 染色显示肝脏形态结构保存完好，其特征是主要存活的肝细胞，具有清晰可见的细胞核和肝窦的轻度扩张。

Introduction

肝移植是终末期肝病患者的金标准治疗。令人遗憾的是，对捐献器官的需求超过了现有供应，导致严重短缺。2021 年，约有 24,936 名患者在等待肝移植的名单上，而只有 9,234 例移植成功进行¹。肝移植物供需之间的巨大差异凸显了研究替代策略以扩大供体库和提高肝移植物可及性的迫切需要。扩大捐助者库的一种方法是使用边际捐助者².边缘捐赠者包括高龄、中度或重度脂肪变性的人。尽管边缘器官移植可能会产生有利的结果，但总体结果仍然不理想。因此，目前正在制定旨在增强边际捐赠者功能的治疗策略^3,4。

其中一种策略是利用机器灌注，特别是常温氧合机灌注，来改善这些边缘器官的功能⁵。然而，对常温氧合机灌注（NEVLP）有益作用的分子机制仍然了解有限。小鼠具有丰富的转基因菌株，是研究分子途径的宝贵模型。例如，自噬途径在减轻肝缺血再灌注损伤中的重要性已得到越来越多的认可^6,7。肝缺血再灌注损伤中一条重要的分子途径是 miR-20b-5p/ATG7 途径⁸。目前，有许多ATG敲除和条....

Protocol

动物实验是根据现行的德国动物福利法规和指南以及ARRIVE动物研究报告指南进行的。动物实验方案由德国图林根州Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz批准（批准号:UKJ - 17 - 106）。

注意:将体重34±4g（平均值[SEM]的平均±标准误差）的雄性C57BL / 6J小鼠用作肝脏供体。它们在受控的环境条件下（50%湿度和18 - 23°C）下保持，并自由获取标准小鼠食物和水。在整个手术过程中，呼吸频率保持在60次/分钟以上，体温保持在34°C以上。

1. 准备

1. 设置操作表
   1. 高压灭菌所有手术器械和耗材以进行灭菌。
   2. 打开所有设备，包括加热板和电凝。
   3. 将一个装有25mL肝素化（2,500U / L）盐水的50mL注射器置于温暖的培养箱（37°C）中。
   4. 将手术器械、6 - 0 丝缝线、无菌小棉涂抹器、兽医盐水（500 mL）和无纺布海绵（10 cm x 10 cm）适当地放在手术台上。
   5. 将 26 G 针头放在手术台上，在 0.5 mL 微量离心管的盖子上开一个小孔，以接收胆管以进行胆汁收集。
   6. 将套管（1 Fr 聚氨酯插管或 UT - 03 聚乙烯插管）和无菌的 0....

Results

建立外科手术
本实验共使用17只动物:14只小鼠用于优化器官获取过程，包括门静脉（PV）和胆管（BD）的插管，而3只小鼠用于验证该程序（表1）。比较组织学结果（图3）以方便确定最佳灌注条件。

灌注液的选择
本研究选择了以前使用的肝细胞培养基^10,11。William's E培养基最初由Williams和Gunn设计为血清还原培养基，用于延长成熟大鼠肝上皮细胞的体外培养¹²。尽管如此，它也发现了支持啮齿动物肝细胞生长和维持的实用性¹³。胎牛血清（FBS）是一种广泛使用的细胞培养补充剂，因为它富含促进细胞生长，增殖和活力的必需营养素和生长因子¹⁴

Discussion

协议中的关键步骤
肝植的两个关键步骤是门静脉插管（PV）和随后的胆管插管（BD）。这些步骤对于确保成功的器官取回和随后的灌注或移植程序至关重要。

挑战和解决方案
PV插管存在三个挑战:血管壁的损伤，导管的移位和插入过程的实用性。PV血管壁的脆弱性质使其在插管过程中不小心处理，容易被刺穿和随后的出血。此外，PV的任何失血都会降低门静脉压力，使插入PV套管更具挑战性。此外，门静脉壁损伤可能会将空气栓子引入肝内血管系统。因此，在PV插管过程中保持精确和谨慎对于最大程度地降低并发症的风险至关重要。

在PV插管期间，导管移位的风险是一个常见的问题，特别是在使用带有光滑材料的插管时。与聚丙烯相比，使用聚氨酯插管更有利于PV插管。聚氨酯的柔软和柔韧性大大降低了导管移位或丢失的风险，这可能是由于其材料特性。此外，使用软套管可最大程度地减少损伤血管内皮层的可能性。在研究中，比较了三种类型的血管通路插管，即24 G聚丙烯，26 G聚丙烯和2 Fr聚氨酯，用于PV插管。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 ml 微管 PP	Sarstedt	72699
1 Fr 橡胶套管	Vygon	样品套
10 µL 微型注射器	Hamilton	701N
2 Fr 橡胶套管	Vygon	样品套管
24 G 蝶形套	Terumo	SR+OF2419
26 G 蝶形套	Terumo	SR+DU2619WX
30 G 皮下注射针	Sterican	100246
50 ml 注射器泵	Braun	110356
6-0 Perma-Hand Seide	Ethicon	639H
动脉夹	Braun	BH014R
可高温高压灭菌湿室	Hugo Sachs Elektronik	73-4733
大棉花涂抹器	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974018
气泡捕集器	Hugo-Sachs-Elektronik	V83163
Buprenovet （0.3 mg / ml）	Elanco	/
CIDEX OPA 溶液 （2 L）	Cilag GmbH	20391
单极切割电外科装置 VIO® 50 C	ERBE	/
胎牛血清（500 ml）	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
气体混合物（95% 氧气和 5% 二氧化碳）	房屋供应	/
加热循环浴哈	佛仪器	75-0310
肝素 5000（即/5 毫升）	博朗	1708.00.00
氢化可的松（100 毫克/2 毫升）	辉瑞	15427276
胰岛素（100 IE/毫升）	Sigma	I0516-5ML
虹膜剪刀	精细科学仪器	15000-03
氟醚（250毫升）	Cp-Pharma	1214
膜氧合器	Hugo Sachs Elektronik	T18728
显微手术显微镜	Leica	M60
鼠标收整套装	Carfil Quality	180000056
NanoZoomer 2.0 HT	滨松	/
无纺布海绵	Kompressen	866110
青霉素链霉素 （1 mg / ml）	C.C.Pro	Z-13-M
灌注延长管 （30 cm）	Braun	4256000
蠕动泵	Harvard-Apparatus	P-70
培养皿 100x15 mm	VWR®	391-0578
Povidon-Jod（Vet-Sep 喷雾）	Livisto	799-416
压力传感器模拟器	UTAH 医疗产品	650-950
可重复使用的血压传感器	AD Instruments	MLT-0380/D
S &T型血管插管钳	精细科学仪器	00608-11
小型棉布涂抹器	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974116
直镊子10厘米	Fine Science Instruments	00632-11
缝合打结钳	Fine Science Instruments	11063-07
注射器 50ml 原装灌注器	Braun	8728810F-06
UT - 03 套管	独特医疗，日本	/
Vannas 弹簧剪刀	Fine Science Instruments	15018-10
兽用盐水（500 毫升）	WDT	18X1807
水套式储液罐  2 L	哈佛仪器	73-3441
William's E 培养基 （500 ML）	Thermofischer Scientific	A1217601