本方案描述了接种物的制备、利用结晶紫染色在微孔板上对生物膜进行定量、生物膜中的活菌计数，以及对不动杆菌属（Acinetobacter）生物膜的可视化观察。
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摘要
摘要
不动杆菌 引起医院内感染，其生物膜的形成有助于该菌在干燥表面（如医院环境）中存活。因此，生物膜的定量与可视化是评估其潜在风险的重要方法 不动杆菌 菌株引起医院感染的能力。可在微量滴定板表面形成的生物膜，通过体积和细胞数量进行定量。生物膜体积可通过结晶紫染色、洗涤、乙醇脱色后，使用微量滴定板读数仪测定溶解的染料量来定量。为定量嵌入生物膜中的细胞数量，可使用细胞刮刀将生物膜刮下，收集至生理盐水中，在玻璃珠存在下剧烈振荡，随后涂布于不动杆菌属琼脂培养基上。然后将平板在30 °C下孵育24–42小时。孵育结束后，计数红色菌落以估算生物膜中的细胞数量。该活菌计数法也可用于计数 不动杆菌 混合物种生物膜中的细胞。 不动杆菌 生物膜可通过荧光染料进行可视化。采用一种市售的专为显微分析设计的微孔板来形成生物膜。随后，对附着于孔板底部表面的生物膜使用SYTO9和碘化丙啶染料染色，经洗涤后，利用共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
引言
Acinetobacter 已知可引起医院内感染，其在医疗机构中导致的人类感染病例日益增多1。该菌广泛存在于医院、医疗机构以及与食品相关的环境中2,3,4。它可在包括病床护栏、床头柜、呼吸机表面以及洗手池等多种医院环境表面长期存活4。这种在环境表面的持续存在可能是导致Acinetobacter医院内感染的重要因素之一4。
生物膜是一种微生物生命形式，是由活的微生物细胞及其细胞分泌的胞外聚合物（EPS）组成的微生物基质5。微生物细胞被包裹在该基质中，通常对热、盐、干燥、抗生素、消毒剂和剪切力等环境胁迫具有高度抗性6,7。
Acinetobacter 可在表面形成生物膜，表明其可能有助于在环境表面（包括医院环境表面）长期存活，并增强对抗生素治疗的耐药性
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方案
1. 细菌接种物的制备
- 从-80 °C冰箱中取出甘油保存管。
- 使用无菌移液器吸头从保存管中取出细菌菌株（2-10 µL）。
注意：Acinetobacter 属的菌株，包括 A. bouvetii（13-1-1）、A. junii（13-1-2）、A. pittii（13-2-5）、A. baumannii（13-2-9）、A. radioresistens（20-1）和 A. ursingii（24-1），均适用于本实验方案。 - 将细菌接种至市售的血琼脂平板（含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂，参见材料表）上。
注意：也可使用其他培养基，如营养琼脂或麦康凯琼脂。 - 使用无菌接种环在琼脂表面划线，并在划线过程中间断灼烧接种环以稀释菌液。
- 将琼脂平板倒置放入培养箱中，在30 °C条件下培养过夜，时间为20-24小时。
- 用无菌接种针挑取单个菌落，接种至5 mL无菌脑心浸出液肉汤（BHI，参见材料表）中。
- 将接种后的肉汤置于摇床培养箱中，在30 °C、约150 rpm条件下振荡培养过夜，时间为20-24小时。
- 取1 mL过夜培养物转....
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结果
按照方案，进行生物膜的培养 不动杆菌 分离株最初从厨房表面分离，在聚苯乙烯96孔板上形成生物膜，经结晶紫染色后，用乙醇溶解染料并测定生物膜量（图1）。生物膜的数量因菌株而异，差异显著，OD值范围从0.04到1.69（图1）。根据 Stepanović 等人建立的标准16除……外，所有分离株 A. bouvetii 形成的生物膜。 A. radioresistens 形成弱生物膜。A. junii 和 A. baumannii 形成中等程度的生物膜，而 A. pittii 和 A. ursingii 形成强生物膜。
为了计数生物膜中的活细胞，使用细胞刮刀将生物膜刮下，高速涡旋振荡，稀释后涂布于Acinetobacter选择性平板上。培养后，通过计数菌落数量来估算生物膜中的细胞数.......
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讨论
采用所述方案，对不同程度的不动杆菌（Acinetobacter）分离株的生物膜形成能力进行了测定和可视化，并估算了生物膜中的活菌数量（图1、图2 和 图3）。
在本实验方案中，使用了两种不同的温度，即 30 °C 用于 Acinetobacter 的生长，25 °C 用于其生物膜的形成。选择 30 °C 是因为许多研究采用高于 30 °C 的温度以实现 Acinetobacter 的最佳生长，该温度适用于获得足够的接种物12,13,14,17。然而，这一温度通常高于生物膜实际形成环境的温度，例如医院.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国食品研究所（KFRI）的主要研究项目（E0210702-03）资助，该项目由科学技术信息通信部资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔细胞培养板 | SPL | 30096 | 聚苯乙烯96孔板 |
| 脑心浸液（BHI）肉汤 | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| 血琼脂基础平板 | KisanBio | MB-B1005-P50 | 不动杆菌的生长培养基 |
| CHROMagar 不动杆菌选择性平板 | CHROMagar | AC092 | 不动杆菌的选择性平板 |
| 结晶紫溶液 | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD 生物膜活力检测试剂盒 | Invitrogen | L10316 | SYTO9 和碘化丙啶 |
| 酶标仪 | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | 用于生物膜检测 |
| RBC 玻璃涂布珠 | RBC | RG001 | 玻璃珠 |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | 适用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的微孔板 |
参考文献
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food ....
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