В этом протоколе описывается процедура выделения мелких внеклеточных везикул из макрофагов методом дифференциального ультрацентрифугирования и извлечения пептидома для идентификации с помощью масс-спектрометрии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Идентификация пептидов малых внеклеточных везикул из макрофагов костного мозга
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Малые внеклеточные везикулы (sEV) обычно секретируются путем экзоцитоза мультивезикулярных телец (MVB). Эти нановезикулы диаметром <200 нм присутствуют в различных жидкостях организма. Эти sEV регулируют различные биологические процессы, такие как транскрипция и трансляция генов, пролиферация и выживание клеток, иммунитет и воспаление с помощью своих грузов, таких как белки, ДНК, РНК и метаболиты. В настоящее время разработаны различные методы выделения sEV. Среди них метод, основанный на ультрацентрифугировании, считается золотым стандартом и широко используется для выделения sEV. Пептиды представляют собой биомакромолекулы длиной менее 50 аминокислот. Эти пептиды участвуют в различных биологических процессах с биологической активностью, таких как гормоны, нейротрансмиттеры и факторы роста клеток. Пептидом предназначен для систематического анализа эндогенных пептидов в специфических биологических образцах методом жидкостной хромато-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС). Здесь мы представили протокол для выделения sEV методом дифференциального ультрацентрифугирования и экстрагированного пептидома для идентификации с помощью ЖХ-МС/МС. Этот метод идентифицировал сотни пептидов, полученных из sEVs, из макрофагов, полученных из костного мозга.
Введение
Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) диаметром менее 200 нм присутствуют почти во всех типах жидкостей организма и секретируются всеми видами клеток, включая мочу, пот, слезы, спинномозговую жидкость и околоплодныеводы. Первоначально sEV рассматривались как контейнеры для утилизации клеточных отходов, что привело к минимальным исследованиям в последующеедесятилетие. В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что sEV содержат специфические белки, липиды, нуклеиновые кислоты и другие метаболиты. Эти молекулы транспортируются к клеткам-мишеням3, способствуя межклеточной комму....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выделение мелких внеклеточных везикул
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте центрифугирование на этапах 1.1-1.11 при температуре 4 °C.
- Приготовление фетальной бычьей сыворотки без sEVs (FBS): центрифуга FBS в течение ночи при 110 000 × г при 4 °C через ультрацентрифугу (см. таблицу материалов) для удаления эндогенных sEV. Соберите надосадочную жидкость, простерилизуйте ее ультрафильтрационной мембраной 0,2 мкм и храните при температуре -20 °C.
- Распределите примерно 3 x 10,7 иммортализированных макрофагов костного мозга (iBMDM) на 150 мм чашку для культивирования и добавьте 20 мл ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для sEV, выделенных с помощью дифференциального ультрацентрифугирования (рис. 1), мы оценили их морфологию, распределение частиц по размерам и белковые маркеры в соответствии с Международным обществом внеклеточных везикул (ISEV)17.
Во-первых, морфология sEV наблюдалась с помощью ПЭМ, демонстрируя типичную чашеобразную структуру (рис. 2A). NTA показала, что изолированные sEV были в основном сконцентрированы на д.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
При исследовании функции sEV крайне важно получить sEV высокой чистоты из сложных биологических образцов, чтобы избежать любого потенциального загрязнения. Разработано множество методов выделенияsEV13, и среди этих методов методы, основанные на дифференциальном ультрацентрифугировании, показали относительно высокую чистоту sEV. В данном исследовании в течение 6 ч собирали 200 мл клеточной надосадочной жидкости, а методом дифференциального ультрацентрифугирования получали около 200-300 мкг sEV. Одн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Исследование выполнено при поддержке грантов Фонда естественных наук Китая (3157270). Благодарим д-ра Фэн Шао (Национальный институт биологических наук, Китай) за предоставление iBMDM.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор для анализа белка BCA | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Центробежная фильтрующая трубка | Millipore | UFC5010BK | |
| Центрифуга Бутылки полипропилен | Beckman Coulter | 357003 | Высокоскоростная центрифуга |
| Хемилюминесцентный субстрат | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 г |
| DMEM культуральная среда | Cell World N | ? Высокоскоростная | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | (JA-25.50) | |
| Иммортализированные макрофаги, полученные из костного мозга (iBMDM) | Национальный институт биологических наук, Китай | Предоставлено доктором Фэн Шао (Национальный институт биологических наук, Китай) | |
| Йодоацетамид | Sigma | l1149 | 5 г |
| Микрофуге пробирка полипропилена | Beckman Coulter | 357448 | 1,5 мл, настольная ультрацентрифуга |
| нано-высокопроизводительная система LC | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| для анализа отслеживания наночастиц | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X масс-спектрометр | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Фосфатно-солевой буфер | Solarbio | P1020 | |
| Полиалломерные центрифужные пробирки | Beckman Coulter | 326823 | Ультрацентрифуга |
| Ингибитор протеазы | Bimake | B14002 | |
| Вакуумный концентратор | SpeedVac Eppendorf | Concentrator plus | |
| Настольная ультрацентрифуга | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ультрацентрифуга ротор (TLA 55) |
| Просвечивающий электронный микроскоп | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ультрацентрифуга | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ультрацентрифуга ротор (SW32 Ti) |
| Ультразвуковой клеточный разрушитель | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-актин | Sigma | A3853 |
Ссылки
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
- Mathieu, M., Marti....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
