פרוטוקול זה מציג מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפרים ושיטת הדמיה תלת-ממדית לחקר השינויים המכנוביולוגיים של התפר ועיצוב מחדש של העצם תחת העמסת כוח מתיחה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טכניקת הדמיה תלת-ממדית לעיצוב מחדש של עצם במודל עכבר הרחבת תפר
במאמר זה
סיכום
תקציר
תפרים קרניופלציאליים ממלאים תפקיד מכריע מעבר להיותם מפרקים סיביים המחברים עצמות גולגולתיות; הם משמשים גם כנישה העיקרית לצמיחת עצם קלווארית ופנים, המאחסנים תאי גזע מזנכימליים ואבות ניווניים. מכיוון שרוב עצמות הגולגולת מתפתחות באמצעות אוסיפיקציה תוך ממברנית, אזורי השוליים של התפרים משמשים כנקודות התחלה. בשל חשיבות זו, תפרים אלה הפכו למטרות מסקרנות בטיפולים אורתופדיים כמו הרחבת קמרון גולגולת בסיוע קפיץ, הרחבה מקסילרית מהירה ומשיכה מקסילרית. תחת כוח מעקב אורתופדי, תאי גזע התפרים מופעלים במהירות, והופכים למקור דינמי לעיצוב מחדש של העצם במהלך הרחבה. למרות חשיבותם, השינויים הפיזיולוגיים במהלך תקופות שיפוץ העצם עדיין אינם מובנים. שיטות החתך המסורתיות, בעיקר בכיוון הסגיטלי, אינן לוכדות את השינויים המקיפים המתרחשים לאורך התפר כולו. מחקר זה ביסס מודל עכבר סטנדרטי להרחבת תפר קשת. כדי להמחיש באופן מלא שינויים בעיצוב מחדש של העצם לאחר הרחבת התפרים, שיטת ניקוי הרקמה של פגסוס שולבה עם צביעת EdU בהרכבה מלאה ותיוג כפול של כלאט סידן. זה איפשר הדמיה של תאים מתרבים מאוד והיווצרות עצם חדשה על פני כל העצמות הקלוואריאליות לאחר ההתרחבות. פרוטוקול זה מציע מודל סטנדרטי של עכבר הרחבת תפרים ושיטת הדמיה תלת-ממדית, השופכת אור על השינויים המכנוביולוגיים בתפרים ובעיצוב מחדש של העצם תחת עומס כוח מתיחה.
מבוא
תפרים קרניופלציאליים הם רקמות סיביות המחברות בין עצמות גולגולת וממלאות תפקידים חיוניים בצמיחה ושיפוץ של עצמות גולגולתיות. מבנה התפר דומה לנהר, ומספק זרימה של משאבי תאים כדי להזין ולבנות את "גדת הנהר", המכונה חזיתות אוסטאוגניות, התורמות להיווצרות עצמות גולגולת באמצעות אוסטאוגנזה תוך ממברנית1.
העניין בתפרים קרניופלציאליים מונע על ידי צרכים קליניים להבין סגירה מוקדמת של תפרים גולגולתיים ותפקוד לקוי של תפרי הפנים, מה שעלול להוביל לעיוותים גולגולתיים ואף למצבים מסכני חיים אצל ילדים. כריתת סוטורקטומיה פתוחה משמשת באופן שגרתי בטיפול קליני, אך מעקב ארוך טווח הראה הישנות לא מלאה של אוסיפיקציה חוזרת בחלק ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (SH9H-2023-A616-SB). במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6 בני 4 שבועות. כל המכשירים בהם נעשה שימוש עוקרו לפני ההליך.
1. הכנת מודל הרחבת התפרים
- הכנת שני בעלי שמירה.
- השתמש בחוט אוסטרלי בגודל 0.014 אינץ' או חוט נירוסטה (ראה טבלת חומרים) ליצירת לולאה סלילית עם צבת חוט קלה. קוטר הלולאה הוא 2 מ"מ, והזנב בקוטר 1 מ"מ שמור משני הצדדים (איור 1A).
- יש לעקר את החוטים והמחזיקים לצורך הניתוח באוטוקלאב, מעקר ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות פרוטוקול זה נקבע מודל עכברי להרחבת תפר סגיטלי (איור 1-2). לצורך הדמיה תלת-ממדית של שינויים במידול העצם לאחר הרחבת התפרים, יושמה שיטת ניקוי רקמות פגסוס על כל עצמות הקלוואריה לאחר הרחבה. לאחר הזילוח הופרדו עצמות קלווריאלי (איור 3A), והמשיך בתהליך פגסוס המתאים (טבלה 1 וטבלה 2). למרבה הפלא, עצמות קלווריאלי נעשו כמעט שקופות לאחר תהליך פגסוס המלא, ללא קשר לשאלה אם בוצע דה-קלקציה (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יישמנו מודל סטנדרטי של עכבר הרחבת תפר כדי לבחון את השינויים המורפולוגיים הקבועים המתרחשים מדי שבוע במהלך כל מחזור השיפוץ בן החודש10. מודל זה שימושי לחקר עיצוב מחדש והתחדשות עצם קלווריאלית על ידי הרחבת תפרים קלווריאליים, כמו גם לחקר תאי תפר שונים in vivo. כדי להציג באופן מלא את התוצאות של מחקר כזה, הדמיה תלת מימדית של רקמות מוכתמות נדרש. לכן, טכנולוגיית פגסוס, הידועה ביעילותה בפינוי רקמות קשות19,20, שולבה עם תיוג כפול וצביעה של EdU.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים על פלטפורמת המעבדה והסיוע של מכון האוזן, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאוטונג בשנחאי. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית שנחאי פוג'יאנג (22PJ1409200); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '11932012); קרן המחקר המדעי לפוסט-דוקטורט של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי; מימון תוכנית מחקר בסיסית של בית החולים העממי התשיעי המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (JYZZ154).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 37% תחריט חומצה | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| אליזרין אדום | סיגמא-אולדריץ' | A3882 | |
| חוט אוסטרלי | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| בנזיל בנזואט | סיגמא-אולדריץ' | B6630 | |
| ירוק סיגמא-אולדריץ | ' | C0875 | |
| נחושת (II) סולפט, נטול מים | סנגון ביוטק | A603008 | |
| דינמומטר | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU Invitrogen | E104152 | ||
| לייזר קונפקסקופ קונפוקלי | Leica | SP8 | |
| PBS | סנגון ביוטק | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | סיגמא-אולדריץ' | ||
| PFA | סיגמא-אולדריץ' | P6148 | |
| מדי pH | מטלר טולדו | S220 | |
| קוואדרול | סיגמא-אולדריץ' | 122262 | |
| נתרן אסקורבט | סיגמא-אולדריץ' | A4034 | |
| סודיום ביקרבונט | סנגון ביוטק | A500873 | |
| נתרן כלורי | סנגון ביוטק | A610476 | |
| נתרן הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | S5881 | |
| אביב | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| סולפו-ציאנין3 אזיד | Lumiprobe | A1330 | |
| טרט-בוטנול | סיגמא-אולדריץ' | 360538 | יש להגן מפני אור. אין להקפיא. |
| Transbond MIP פריימר לא רגיש ללחות | 3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT משחת דבק לריפוי קל | 3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered | Sangon Biotech | A500027 |
מקורות
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
