このプロトコルは単一セルの分類方法を使用して人間のmesenchymal幹細胞の蛍光活動化させたセル分類の使用を記述する。具体的には、シングルセルソーティングの使用は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせることで、不均一な集団から免疫表現型細胞の99%の純度を達成することができます。
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方法論記事
ヒト剥離乳歯由来の免疫表現型間葉系幹細胞の単一細胞選別
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
生物の間葉系幹細胞(MSC)は、体内の成体細胞の複数の系統に分化する並外れた能力を持ち、免疫調節および抗炎症特性で知られています。これらの幹細胞の使用は、再生生物学の分野に恩恵をもたらしますが、同時に、それらに関連する複数の細胞の曖昧さのために、再生医療や治療薬にとって悩みの種でもあります。これらの曖昧さは、これらの幹細胞の供給源の多様性とin vitro での増殖条件から生じる可能性があり、どちらも機能的な不均一性を反映しています。
これにより、治療用途のために精製された均質なMSC集団を提供する方法論が保証されます。フローサイトメトリーの分野の進歩により、マルチパラメトリックアプローチを用いた単一細胞集団の検出が可能になりました。このプロトコルは蛍光助けられた単一セルの分類によって人間のexfoliated乳歯の(小屋)からの幹細胞を識別し、浄化する方法を概説する。表面マーカー、すなわちCD90-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、CD73-ペリジニン-クロロフィルタンパク質(PerCP-Cy5.5)、CD105-アロフィコシアニン(APC)、およびCD44-V450の同時発現により、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いてMSCの「明るい」陽性発現因子が同定されました。しかし、これらの陽性マーカーの四重発現者の割合は、継代7以降から後の継代にかけて有意な低下が観察された。
免疫表現型サブポピュレーションは、2つの陽性マーカーと1つの陰性マーカーのみが選択基準を構成する単一細胞ソートモードを使用してソートされました。この方法論により、選別した集団の細胞生存率が保証され、選別後の細胞増殖が維持されました。このようなソーティングの下流アプリケーションは、ゲーテッド亜集団の系統特異的な分化を評価するために使用できます。このアプローチは、他のシングルセルシステムに適用して、単離条件を改善し、複数の細胞表面マーカー情報を取得することができます。
概要
間葉系幹細胞(MSC)は、細胞ベースの治療に適したスケーラブルな細胞供給源と見なすことができ、再生医療のゴールドスタンダードシステムと見なすことができます。これらの細胞は、異なる組織起源を有する体内のさまざまな供給源から単離することができる1。MSCの各タイプは、その発生源組織に応じて、曖昧なin vitro挙動を示します2。これは、それらの形態学的および機能的特性によく見られます3。複数の研究により、成体組織の分化、ゲノム状態、MSCの代謝および細胞構造など、寸法のクローン内変動が示されています2,4。
細胞のイムノフェノタイピングは、幹細胞の同定のためのフローサイトメトリーの一般的なアプリケーションであり、これは2006年に国際細胞遺伝子治療学会(ISCT)によって利用され、細胞をMSCとして識別するための最小限の基準のリストを規定しました。それは、プラスチック接着とin vitroで3つの系統(骨形成性、軟骨形成性、脂肪形成性)に分化する能力に加えて、細胞集団の≥95%がCD105、CD73、CD90を発現しなければならず、これらの細胞はフローサイトメトリーで測定されたCD34....
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プロトコル
倫理的承認と参加への同意: ヒト剥離乳歯髄サンプルは、インフォームド コンセントと完全な倫理的承認を取得した後、バンガロールの Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) 口腔顎顔面部門によって、病院倫理クリアランス委員会、SRGCDS によって確立された基準に従って受け取られました。その後、SHEDの分離、培養、維持、および適用が、MAHE-バンガロールのManipal Institute of Regenerative MedicineのInstitutional Committee for Stem Cell Research(IC-SCR)によって推奨されたガイドラインによって承認され、これに準拠しました。このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 試薬・緩衝液の調製
- 培養維持に
- 未分化ヒトES細胞の基礎培地、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-strep)を使用してMSC細胞培養培地(10%)を調製します(表2)。
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結果
SHEDは、ビメンチン(赤色、III型中間フィラメント)、アクチンフィラメント(Alexa fluor 488 Phalloidin Probes)、およびDAPIで染色した核の発現を示す標準的な免疫蛍光アッセイで特性評価しました(図1A)。それらの増殖能力およびコロニー形成能力を推定するために、標準的な短期細胞増殖アッセイを実施しました。2日目から8日目にかけて増殖率が14.3倍に増加したことが図1Bに示されています。SHEDのクローン形成特性は、図1C-Eに示すCFU-Fアッセイから決定しました。ISCT基準に従って、多能性MSCは3つの中胚葉由来の系統に分化することができました。分化した脂肪細胞の油滴を検出するために、Oil Red Oによる細胞化学的染色を使用しました(図1F)。分化した骨芽細胞のマトリックスに見られるカルシウ.......
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ディスカッション
組織工学および再生医療の分野では、出生後の情報源の中で、口腔組織由来のMSCは、その最小限の倫理的義務と顕著な多系統分化の可能性のために、深い関心を集めています21。影響を受けた第3大臼歯由来の歯髄幹細胞(DPSC)とSHEDは、神経変性疾患および外傷性疾患における治療の可能性について、歯科間幹細胞の中で最も注目を集めています22。この原稿で説明するプロトコルは、マルチパラメトリックアプローチを使用してSHEDを特徴付け、シングルセルソートアプローチを使用して目的の集団をさらにソートするのに役立ちます。しかしながら、このプロトコルの適用は、経口MSCに限定されるだけでなく、人体における他の源組織からのMSCのイムノフェノタイピングおよび選別にも用いることができる23。
このプロトコルのいくつかの重要なステップは、対処された生物学的問題の実装を成功させるために、ここで議論する必要があります。すべての選別プロトコルの鍵は、生物学的コントロールと.......
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開示事項
著者らは、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言します。
謝辞
インドのバンガロールにあるジャワハルラール・ネルー先端科学研究センターのフローセル施設には、フローサイトメトリーのコア施設をご利用いただき、感謝いたします。分化細胞のペレット培養の凍結切片は、インドのバンガロールにあるNeuberg Anand Reference Laboratoryで実施されました。この研究は、インドのマニパル高等教育アカデミー(MAHE)からのUCの学内資金によって支援されました。AGは、MAHEからのDr. T. M. A. Pai Scholarshipの支援に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アルシアンブルーステイン | HiMedia | CCK029-1KT | |
| 抗生物質-抗真菌剤(100x) | 15240062 | の Gibco | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig、 κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 & micro;m) パーティクルセット | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences 345249 | ソートモジュールが開いたときのレーザー遅延を設定するために使用されます。 | |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS シース液 | BD Biosciences | 342003 | BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T研究ビーズ | BD Biosciences | 655050 | ノズルサイズに応じて機器構成に使用されます。 |
| BD Horizon V450 マウス 反ヒト CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 マウス IgG2b, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 アイソタイプ |
| BD Pharmingen APC マウス 抗ヒト CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC マウス IgG1, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC アイソタイプ |
| BD Pharmingen DAPIソリューション | BD Biosciences | 564907 | DAPI1 mg/mLのストック溶液 |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC アイソタイプ |
| BD Pharmingen PE マウス 抗ヒト CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE マウス IgG1, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE アイソタイプ |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 マウス 抗ヒト CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 マウス IgG1, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 アイソタイプ |
| BD Pharmingen 精製マウス 抗ビメンチン | BD Biosciences | 550513 | |
| ウシ血清アルブミン | Hi-Media | TC548-5G | |
| クリスタルバイオレット | ニースケミカル社 | C33809 | |
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBSを培養作業やメンテナンスに使用。 |
| エタノール | --- | --- | 一般的な滅菌に使用されます。 |
| ウシ胎児血清 | ThermoFisherのGibco | 10270-106 | |
| ヤギ抗マウスIgG(H+L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | 分子 |
| -グルタミン 200mM (100x) | Gibco | ||
| ハイメディア | MB113 | ||
| オイルレッド O | ハイメディア | CCK013-1KT | |
| パラホルムアルデヒド | loba chemie | 30525-89-4 | |
| ペニシリン ストレプトマイシン (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| ファロイジン (ActinGreen 488 ReadyProbes 試薬) | Invitrogen | R37110 | |
| 硝酸銀 | HiMedia | MB156-25G | |
| ナトリウムチオ硫酸塩五水和物 | Chemport | 10102-17-7 | |
| スフェロレインボー蛍光粒子、3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| 染色バッファー | MIRMで作成 | ---- | PBS中の2%FBSを使用して調製しました |
| StemPro脂肪生成分化基礎培地 | ThermoFisherのGibco | A10410-01 | StemPro |
| Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Amopogenic培 |
| StemPro軟骨形成サプリメント | ThermoFisher | A10064-01 | 軟骨形成培地用誘導培地 |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | 骨形成培地用誘導培地 |
| StemPro 骨形成/軟骨形成分化基礎培地 | ThermoFisherのGibco | A10069-01 | 骨原性および軟骨原性培地の両方の基礎培地 |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| トリパンブルー | ライフテクノロジーズによるGibco | 15250-061 | |
| トリプシン - EDTA溶液 1x | Hi-media | TCL049 | |
| トゥイーン-20 | メルク | 〒9005-64-5 |
参考文献
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P.
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