Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, das eine In-vitro-Bewertung der Häufigkeit von fluoreszenzmarkierten microRNAs ermöglicht, um die Dynamik der microRNA-Verpackung und des Exports in extrazelluläre Vesikel (EVs) zu untersuchen.
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Methodenartikel
Verfolgung der miRNA-Freisetzung in extrazelluläre Vesikel mittels Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind wichtige Vermittler der zellulären Kommunikation, die von einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen abgesondert werden. Diese EVs transportieren bioaktive Moleküle, einschließlich Proteine, Lipide und Nukleinsäuren (DNA, mRNAs, microRNAs und andere nicht-kodierende RNAs), von einer Zelle zur anderen, was zu phänotypischen Folgen in den Empfängerzellen führt. Von all den verschiedenen EV-Ladungen haben microRNAs (miRNAs) aufgrund ihrer eindeutigen Dysregulation und Häufigkeit in EVs viel Aufmerksamkeit für ihre Rolle bei der Gestaltung der Mikroumgebung und bei der Bildung von Empfängerzellen auf sich gezogen. Weitere Daten deuten darauf hin, dass viele miRNAs aktiv in EVs geladen werden. Trotz dieser eindeutigen Beweise ist die Forschung über die Dynamik des Exports und die Mechanismen der miRNA-Sortierung begrenzt. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die durchflusszytometrische Analyse von EV-miRNA verwendet, um die Dynamik der EV-miRNA-Beladung zu verstehen und die am miRNA-Export beteiligten Maschinen zu identifizieren. In diesem Protokoll werden miRNAs, die in EVs angereichert und aus Spenderzellen abgereichert sind, an ein Fluorophor konjugiert und in die Spenderzellen transfiziert. Die fluoreszenzmarkierten miRNAs werden dann mittels qRT-PCR auf das Laden in EVs und die Depletion aus den Zellen überprüft. Sowohl als Transfektionskontrolle als auch als Werkzeug zum Gating der transfizierten Zellpopulation ist eine fluoreszenzmarkierte zelluläre RNA (zellretiniert und EV-depleted) enthalten. Zellen, die sowohl mit der EV-miRNA als auch mit der zellretinierten miRNA transfiziert wurden, werden über einen Zeitraum von 72 h auf Fluoreszenzsignale untersucht. Die für die EV-miRNAs spezifische Fluoreszenzsignalintensität nimmt im Vergleich zur zellretinierten miRNA rapide ab. Mit diesem einfachen Protokoll konnte man nun die Dynamik der miRNA-Beladung beurteilen und verschiedene Faktoren identifizieren, die für das Laden von miRNAs in Elektrofahrzeuge verantwortlich sind.
Einleitung
MicroRNAs (miRNAs) sind eine der am besten charakterisierten Untergruppen kleiner nicht-kodierender RNAs, die für ihre entscheidende Rolle bei der posttranskriptionellen Genregulation bekannt sind. Die Expression und Biogenese der meisten miRNAs folgt einer koordinierten Abfolge von Ereignissen, die mit der Transkription der primären miRNAs (pri-miRNAs) im Zellkern beginnt. Nach der Kernprozessierung durch den Mikroprozessorkomplex zu Vorläufer-miRNAs (Prä-miRNAs) werden die Prä-miRNAs in das Zytoplasma exportiert, wo sie von der RNase-III-Endonuklease weiterverarbeitet werden, die zu 21-23 nukleotidreifen miRNA-Duplexen verarbeitet wird1. Eine....
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Protokoll
HINWEIS: Als Voraussetzung für die Verwendung dieser Technik ist die Identifizierung und Validierung selektiv exportierter miRNAs erforderlich. Da verschiedene Zelllinien je nach der in ihre EVs einsortierten miRNA-Fracht variieren, wird empfohlen, die interessierende Zelllinie und die zugehörigen EVs vor der Verwendung auf miRNAs zu untersuchen. Darüber hinaus ist die Lipofectamin-basierte Transfektion einer der kritischen Schritte im Protokoll. Es wird empfohlen, die Transfektionseffizienz vor dem Aufbau des Experiments im Voraus zu bestimmen.
1. Züchtung von Zellen in Kultur und Transfizierung von Zellen mit Fluorophor-konjugierter....
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Ergebnisse
Hier nutzen wir die Durchflusszytometrie als leistungsfähiges Werkzeug, um die Freisetzung von miRNA aus den Zellen in EVs zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Protokolls ergab die Durchflusszytometrie-Analyse von Zellen, die mit Zell-miRNA und EV-miRNA transfiziert wurden, eine sequentielle Abnahme des Fluoreszenzsignals, das der EV-miRNA entspricht, während das Signal, das der Zell-miRNA entspricht, in den Zellen erhalten blieb. Um sicherzustellen, dass die Fluorophor-Konjugation die miRNA-Freisetzung in EVs nicht b.......
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Diskussion
Das neu etablierte Protokoll ermöglicht es, die Kinetik der miRNA-Freisetzung in EVs nach der Transfektion von EV-miRNAs zu erfassen. Der Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer EV-miRNAs und Zell-miRNAs, abhängig von den Fähigkeiten des Zytometers. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie zwar wertvolle Einblicke in die Biologie von EV-miRNAs liefern, ist aber nicht ohne Einschränkungen. Einige der Einschränkungen können jedoch überwunden werden, wenn sie in Verbindung mit anderen Techniken für ein umfa.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Dr. Jill Hutchcroft, Direktorin der Flow Cytometry Core Facility an der Purdue University, für die Unterstützung und den Rat. Diese Arbeit wurde von R01CA226259 und R01CA205420 an A.L.K., einem American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 an A.L.K., einem Purdue Shared Resource Facility Grant P30CA023168 und einem Flaggschiff-Fulbright-Promotionsstipendium unterstützt, das vom Department of the State, USA, an S.H.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon Röhrchen | Corning | 352097 | |
| 6-Well-Gewebekulturplatten mit klarem Boden und flachem Boden Fisher | Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | Zum Einrichten von Anschnitten und Parametern für die Partikeldetektion |
| Attune Nxt Durchflusszytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | Für die Fluoreszenzanalyse in Elektrofahrzeugen |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | Für die Fluoreszenzanalyse in Zellen |
| Zellkultur-Inkubator | N/A | N/A | Aufrechterhaltung einer Temperatur von 37 ° C und 5 % CO2 |
| Zellkulturmedium | N/A | N/A | , spezifisch für die Zelllinie von |
| Interesse Zelllinie von Interesse | N/A | N/A | Jede Zelllinie, die auf EV und zelluläre Häufigkeit von miRNAs getestet und bewertet wurde. |
| Zell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs, die von der interessierenden Zelllinie beibehalten und nicht selektiv in EVs exportiert |
| EV-miRNA (Fluorophor-konjugierte miRNAs) | Integrierte DNA-Technologien (IDT) | miRNAs, die für die selektive Sortierung in EVs präbestimmt sind | |
| Fluoreszenzmikroskop | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum | Medium Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hämozytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (für Zellkultur) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transkriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | ||
| mirVana RNA Isolierung | Qiagen | AM1561 | |
| Nuklease freies Wasser | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyd, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagenzreservoir unsteril | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0,25% | Fischer | ||
| Ultrazentrifuge | N/A | N/A |
Referenzen
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G.
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Nachdrucke und Genehmigungen
