Os protocolos descritos são novos métodos de visualização de estruturas periféricas na lente ocular com métodos de quantificação de imagens. Estes protocolos podem ser utilizados em estudos para melhor compreender a relação entre as estruturas da microescala do cristalino e o desenvolvimento/função do cristalino.
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Artigo de método
Imagens de montagem completa para visualizar e quantificar a estrutura da lente periférica, a morfologia e a organização da célula
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A lente ocular é um tecido flexível transparente que altera sua forma para focalizar a luz de diferentes distâncias na retina. Além de uma membrana basal que envolve o órgão, chamada de cápsula, o cristalino é inteiramente celular consistindo de uma monocamada de células epiteliais no hemisfério anterior e uma massa volumosa de células de fibra do cristalino. Ao longo da vida, as células epiteliais proliferam na zona germinativa no equador do cristalino, e as células epiteliais equatoriais migram, alongam-se e diferenciam-se em células de fibras recém-formadas. As células epiteliais equatoriais alteram substancialmente a morfologia de células em forma de paralelepípedo aleatoriamente embaladas em células alinhadas em forma de hexágono formando fileiras meridionais. As células de fibras do cristalino recém-formadas retêm a forma de célula hexagonal e se alongam em direção aos polos anterior e posterior, formando uma nova camada de células que são sobrepostas às gerações anteriores de fibras. Pouco se sabe sobre os mecanismos que conduzem a notável morfogênese das células epiteliais do cristalino para as células fibrosas. Para melhor entender a estrutura, o desenvolvimento e a função das lentes, novos protocolos de imagem foram desenvolvidos para obter imagens de estruturas periféricas usando montagens inteiras de lentes oculares. Aqui, métodos para quantificar a espessura da cápsula, a área celular epitelial, a área e a forma nuclear da célula, a ordem e o empacotamento das células da linha meridional e as larguras das células de fibra são mostrados. Essas medidas são essenciais para elucidar as mudanças celulares que ocorrem durante o crescimento do cristalino ao longo da vida e entender as mudanças que ocorrem com a idade ou patologia.
Introdução
A lente ocular é um tecido flexível e transparente situado na região anterior do olho que tem a função de focalizar a luz na retina. A capacidade de funcionamento da lente pode ser atribuída, em parte, à sua intrincada arquitetura e organização 1,2,3,4,5,6. Ao redor do tecido do cristalino encontra-se a cápsula, membrana basal essencial para a manutenção da estrutura e das propriedades biomecânicasdo cristalino 7,8,9
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Protocolo
Os camundongos são alojados na instalação animal da Universidade de Delaware, mantidos em um ambiente livre de patógenos. Todos os procedimentos em animais, incluindo a eutanásia por inalação de CO2 , foram conduzidos de acordo com protocolos animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Delaware (IACUC).
1. Preparação e imagem da montagem completa da lente
- Fixação de lentes para imagens de montagem completa
- Após a eutanásia, enuclear os olhos e dissecar as lentes como descrito anteriormente25. Após a dissecção, transfira as le....
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Resultados
Cápsula anterior do cristalino, área celular epitelial e área nuclear
Para analisar a espessura da cápsula do cristalino, foram coradas as cápsulas do cristalino, em lentes vivas ou fixas, com WGA. Identificamos células epiteliais do cristalino marcando membranas com tdTomato em lentes vivas (Figura 2A), ou via coloração de rodamina-faloidina para F-actina nas membranas celulares em lentes fixas (Figura 2B). Em uma projeção ortogonal (XZ), a .......
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Discussão
Os protocolos descritos permitem a visualização em alta resolução espacial das estruturas e células periféricas do cristalino nas regiões anterior e equatorial do cristalino. Neste estudo, métodos para a visualização das estruturas periféricas das lentes usando lentes intactas (vivas ou fixas) onde a arquitetura geral da lente 3D é preservada foram mostrados. Adicionalmente, métodos simples para análise morfométrica quantitativa usando o software FIJI ImageJ disponível publicamente foram fornecidos. Os métodos de visuali.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Eye Institute Grant R01 EY032056 para CC e R01 EY017724 para VMF, bem como pelo National Institute of General Medical Sciences sob o número de P20GM139760. S.T.I foi apoiado pelo NIH-NIGMS T32-GM133395 como parte do programa de treinamento pré-doutoral da Interface Química-Biologia e por um Prêmio de Pós-Graduação da Universidade de Delaware.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Punção de Biópsia de 3 mm | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimicótico/Antibiótico | Cytiva | SV30079.01 | |
| Albumina de Soro Bovino (Fração V) | Prometheus | 25-529 | |
| Toalhetes de tarefa delicada | Kimwipe | ||
| ( Fluorodish)World | Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Microscópio confocal de varredura a laser 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldeído | Ciências de Microscopia Eletrônica | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Meio sem vermelho de fenol 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rodamina-Faloidina | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
Referências
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734(2012).
- Cheng, C., et al.
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Reimpressões e permissões
