כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם בתסמונת מיאלודיספלסטית ובלוקמיה מיאלואידית חריפה
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מאוכלוסיות תאים נפרדות, כגון תאי סטרומה מזנכימליים, תאי אנדותל, תאי אוסטאו-שושלת ופיברובלסטים, המספקים תמיכה לתאי גזע המטופויטיים (HSC). בנוסף לתמיכה ב-HSC תקין, מיקרו-סביבה של מח העצם ממלאת גם תפקיד בהתפתחות הפרעות תאי גזע המטופויאטיות, כגון תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מוטציות הקשורות ל- MDS ב- HSCs מובילות לחסימה בהתמיינות ואי ספיקת מח עצם מתקדמת, במיוחד אצל קשישים. MDS יכול לעתים קרובות להתקדם AML עמיד לטיפול, מחלה המאופיינת על ידי הצטברות מהירה של פיצוצים מיאלואידים לא בוגרים. מיקרו-סביבה של מח העצם ידועה כמשתנה בחולים עם גידולים מיאלואידים אלה. כאן מתואר פרוטוקול מקיף לבידוד ואפיון פנוטיפי של תאים מיקרו-סביבתיים של מח עצם ממודלים מורינים של תסמונת מיאלודיספלסטית ולוקמיה מיאלואידית חריפה. בידוד ואפיון שינויים באוכלוסיית נישות מח העצם יכול לסייע בקביעת תפקידם בהתחלת המחלה והתקדמותה, ועשוי להוביל לפיתוח טיפולים חדשניים המתמקדים בשינויים מקדמי סרטן באוכלוסיית סטרומה מח העצם.
מבוא
המיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מתאים המטופויטיים, תאי סטרומה לא המטופויטיים והמטריצה החוץ תאית 1,2. מיקרו-סביבה זו יכולה לקדם התחדשות עצמית של תאי גזע המטופויטיים, לווסת התמיינות שושלת ולספק תמיכה מבנית ומכנית לרקמת העצם 1,2,3,4,5. נישת הסטרומה כוללת תאי אוסטאו-שושלת, פיברובלסטים, תאי עצב ותאי אנדותל6, בעוד שהנישה ההמטופויטית מורכבת מאוכלוסיות הלימפה והמיאלואידים 1,2,3
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברים גודלו והוחזקו במתקני הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. כדי למדל MDS בסיכון גבוה, נעשה שימוש בדגם NHD13 murine19 הזמין מסחרית. במודל זה, תאי סטרומה של מח עצם מנותחים בנקבות עכברי NHD13 בגיל 8 שבועות, לפני הופעת המחלה. דה נובו AML נוצרכמתואר קודם 6,11,20. האונקוגנים המשמשים להשראת AML, כגון MLL-AF9 ו-NRas, מתויגים ב-GFP או YFP, ומאפשרים ניתוח של אוכלוסיות מח עצם GFP שאינן לוקמיות באמצעות ציטומטריית זרימה. בקצרה, נקבות עכברי C57....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לניתוח אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם, כגון תאי אנדותל ותאי סטרומה מזנכימליים, ממודלים של MDS ולוקמיה מורין (איור 1). איור 2 מתאר את אסטרטגיית ה-gating לזיהוי אוכלוסיות מעניינות, החל מבחירת התאים (P1) במקטע המעוכל והמדולדל CD45/Ter119 דרך פרופיל פיזור קדימה וצדדית. תאים לדוגמה בדגימת לוקמיה מוצגים ב-P1 (איור 2A). סינגלים נבחרים וכפילים אינם נכללים בניתוח הזה, P2 (איו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודלים של לוקמיה מורנית שימשו באופן נרחב לזיהוי אותות פנימיים ונישתיים של תאים המקדמים התקדמות לוקמיה מיאלואידית אגרסיבית 6,19,21. כאן מוצג פרוטוקול מקיף מבוסס ציטומטריית זרימה להגדרת ההרכב התאי של מיקרו-סביבה של מח העצם במודלים של MDS ו-AML.
לפני קבלת נתונים ציטומטריים של זרימה מדגימות ניסיוניות, חשוב לפצות בזהירות על חפיפה פלואורסצנטית. כמו כן, חיוני לכלול את כל בקרות הצביעה והצביעה המתאימות. צעדים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
תודות
ברצוננו להודות ל-URMC Flow Cytometry Core. עבודה זו נתמכה על ידי פרס האגודה האמריקאית להמטולוגיה, פרס הקרן לחקר לוקמיה ומענקים של NIH R01DK133131 ו-R01CA266617 שהוענקו לג'יי.בי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קצות פיפטה 1 מ"ל | ג'נסי סיינטיפיק | 24-165RL | |
| 1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | AVANT | L211511-CS | |
| 10 ומיקרו; L טיפים פיפטה | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 מ"ל עטוף בנפרד פיפטות סרולוגיות סטריליות | גלובוס מדעי | 1760 | |
| 1000 מ"ל בקבוק סינון ואקום | NEST | 344021 | |
| צינור צנטריפוגה 15 מ"ל | VWR | 10026-076 | |
| 2 מ"ל פיפטה שואבת | NEST | 325011 | |
| 200 ומיקרו; L טיפים פיפטה | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 מ"ל עטוף בנפרד פיפטות סרולוגיות סטריליות | גלובוס מדעי | 1780 | |
| 5 מ"ל עטוף בנפרד פיפטות סרולוגיות סטריליות | גלובוס מדעי | 1740 | |
| 5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול 12 x 75 מ"מ סגנון | פלקון | 352054 | |
| 5 מ"ל פוליסטירן צינור עגול תחתון עם מכסה מסננת תאים 12 x 75 מ"מ סגנון | פלקון | ||
| 352235 צינור צנטריפוגה 50 מ"ל | NEST | 602052 | |
| 6 בארות, תחתית שטוחה עם מכסה אידוי נמוך | פלקון | 353046 | |
| רפידות תחתונות סופגות עם מחסום לחות עמיד למים | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro מפריד | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16/CD32 (עכבר BD Fc Block)BD | Biosciences | 553141 | 0.5 מ"ג/מ"ל |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא-אולדריץ | ' A7906 | 66.000 גרם/מול |
| סגול מבריק 421 נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1) נוגדן (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 מ"ג/מ"ל |
| C57BL/6J עכברים | מעבדת ג'קסון | 664 | |
| מיכל גז פחמן דו חמצני | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) נוגדן חד שבטי (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 מ"ג/מ"ל |
| CD45 נוגדן חד שבטי (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 מ"ג/מ"ל |
| מסננת תאים 70 ומיקרו; מ ניילון | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials מרגמה ועלי; אגת, 125 מ"ל | קול-פארמר | EW-63100-62 | |
| קולגנאז מClostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| קולגנאז מסוג | I STEMCELL | 7415 | |
| קורנינג מיני צנטריפוגה | קורנינג | 6770 | |
| קורנינג סטריפטור אולטרה פיפט | בקר קורנינג | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I מלבלב בקר | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, אבקה | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| אתנול אבסולוטי, KOPTEC, עומד במפרט האנליטי של BP, Ph. Eur., USP (200 הוכחה) | VWR | 89125-174 | |
| מספריים עדינים - חדים | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B סרום בקר עוברי | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L ערכות התחלה לפיפטה | FisherScientific | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| המוציטומטר | פישר | 02-671-10 | |
| אינקובטור | קלסר | C150-UL | |
| Kimwipes KIMTECH | K222101 | ||
| LABGARD Class II, סוג A2 ארון בטיחות ביולוגי | Nuaire | NU-425-400 | |
| עמודות LD | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| מערבולת LSE מערבולת | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| מק מעמד מרובה | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| מסובב צינור MACsmix | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10 מ"ג | 2 מ"ג/מ"ל |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) מעבדת עכברים | ג'קסון | ||
| 010505 PE נגד עכבר CD51 נוגדן (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 מ"ג/מ"ל |
| PE/ציאנין5 נגד עכבר CD140a נוגדן (RUO) | Biolegend 135920 | 0.2 מ"ג/מ"ל | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 מ"ל מזרק | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - תמיסה של 1.0 מ"ג/מ"ל במים | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS מפריד | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus סדרת צנטריפוגה | תרמו מדעית | ||
| TER-119 נוגדן חד-שבטי (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 מ"ג/מ"ל |
| תמיסת טריפן כחולה 0.4% | גיבקו | 15-250-061 | |
| אולטרה-טהור 0.5 מ' EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
מקורות
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
