Обнаружение и количественная оценка ДНК вируса гепатита В (ВГВ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени является чувствительным и точным методом диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Здесь мы представляем протокол обнаружения ДНК ВГВ и измерения вирусной нагрузки в образце.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение и количественная оценка ДНК вируса гепатита В в режиме реального времени на основе полимеразной цепной реакции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вирус гепатита В (ВГВ) является одной из основных причин заболеваний печени во всем мире. Это может привести к острым или хроническим инфекциям, что делает людей очень восприимчивыми к смертельному циррозу и раку печени. Точное обнаружение и количественное определение ДНК ВГВ в крови имеют важное значение для диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Наиболее распространенным методом обнаружения ДНК ВГВ является ПЦР в реальном времени, которая может быть использована для обнаружения вируса и оценки вирусной нагрузки для мониторинга ответа на противовирусную терапию. В этой статье мы опишем подробный протокол обнаружения и количественного определения ДНК ВГВ в сыворотке или плазме крови человека с использованием набора для ПЦР в реальном времени с маркировкой IVD. В наборе используются праймеры и зонды, которые нацелены на высококонсервативную основную область генома ВГВ и могут точно количественно определить все генотипы ВГВ (A, B, C, D, E, F, G, H, I и J). Набор также включает в себя эндогенный внутренний контроль для мониторинга возможного ингибирования ПЦР. Этот анализ рассчитан на 40 циклов, а его пороговое значение составляет 38 Ct. Для количественного определения ДНК HBV в клинических образцах в комплекте с набором поставляется набор из 5 стандартов количественного определения. Стандарты содержат известные концентрации ДНК, специфичной для ВГВ, которые откалиброваны в соответствии с4-м Международным стандартом ВОЗ по ДНК ВГВ для теста на нуклеиновые кислоты (код NIBSC 10/266). Стандарты используются для проверки функциональности амплификации ДНК, специфичной для ВГВ, и для создания стандартной кривой, позволяющей количественно определить ДНК ВГВ в образце. С помощью набора для ПЦР была выявлена ДНК вируса гепатита В до 2,5 МЕ/мл. Высокая чувствительность и воспроизводимость набора делают его мощным инструментом в клинических лабораториях, помогая медицинским работникам эффективно диагностировать и лечить инфекции ВГВ.
Введение
Вирус гепатита В (HBV) представляет собой частично двухцепочечный ДНК-вирус из рода Orthohepadnavirus и семейства Hepadnaviridae 1. Он может спровоцировать хроническую инфекцию, которая сохраняется на протяжении всей жизни, потенциально приводя к циррозу печени и гепатоцеллюлярной карциноме 2,3,4. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2019 году население страны составляло 296 миллионов человек с хронической инфекцией гепатита В, икаждый год 1,5 миллиона человек заражались новыми инфекциями.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В этом исследовании не участвовали люди или клинические образцы. Единственным использованным биологическим материалом был4-й Международный стандарт ВОЗ по ДНК ВГВ для анализа нуклеиновых кислот (код NIBSC 10/266). Настоящий стандарт является общедоступным справочным материалом, не содержащим никакой личной информации или идентифицируемых данных. Таким образом, для этого исследования не требовалось никакого этического одобрения.
1. Экстракция ДНК
- Извлечение вирусной ДНК из образца сыворотки или плазмы крови человека. Выделенную ДНК хранят при -20 °C до дальнейшего использования в ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реко....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Принципиальная схема рабочего процесса по обнаружению и количественному определению ДНК вируса гепатита В из плазмы/сыворотки крови человека показана на рисунке 1. График усиления Стандарта 2 (используется в качестве ПК) и NTC как для HBV, так и для IC показан на рисунке 2. На рисунке 3 показаны кривые амплификации для HBV-положительного образца, HBV-отрицательного образца и образца с ингибированием ПЦР. Кривая амплификации, значени.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Коду NIBSC 10/266 присвоена единица 9,55,000 МЕ/мл при восстановлении в 0,5 мл безнуклеазной воды в соответствии с информацией поставщика21. Это можно считать высоконагруженным HBV-положительным образцом. Вирусная нагрузка ВГВ, определенная с помощью набора вирусной нагрузки, использованного в этом исследовании, составила 6 65 900 МЕ/мл (рис. 4). Поскольку эффективность экстракции ДНК любого набора для экстракции ДНК не равна 100%, часть ДНК часто теряется в процессе .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы связаны с компанией Kilpest India Limited, производителем набора для определения вирусной нагрузки ВГВ, используемого в этом исследовании.
Благодарности
Выражаем благодарность за техническую помощь Правину, Кусуму, Чандану, Ише, Рашми, Бабли, Шивани, Анките и Шикхе.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4th Международный стандарт ВОЗ по вирусу гепатита В ДНК | NIBSC | NIBSC код: 10/266 | 4-й Международный стандарт ВОЗ по ДНК вируса гепатита В (ВГВ), код NIBSC 10/266, предназначен для использования для калибровки вторичных референтных реагентов, используемых в методах амплификации нуклеиновых кислот (NAT) ВГВ. |
| Машины для ПЦР в реальном времени ABI | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | Это машина для ПЦР в реальном времени |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC код: 14/198 | Это очень низкоположительный триплексный реагент для анализов NAT, содержащих гепатит В (HBV), гепатит C (HCV) и вирус иммунодефицита человека-1 (HIV-1) |
| QIAGEN Аппарат для ПЦР в реальном времени | Qiagen | Rotor-Gene Q | Это аппарат для ПЦР в реальном времени |
| Комплект для измерения вирусной нагрузки HBV | Kilpest India Limited | 3B294 | Это набор на основе ПЦР в реальном времени, используемый в этом исследовании для обнаружения ДНК HBV и определения вирусной нагрузки |
| TRUPCR Набор для экстракции вирусных нуклеиновых кислот | Kilpest India Limited | 3B214 | Это набор для экстракции ДНК, используемый для экстракции вирусной ДНК HBV из NIBSC:10/266 и NIBSC:14/198 |
Ссылки
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
