为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体双光子钙成像技术是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。
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摘要
摘要
为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体内进行双光子钙成像，是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。该方法包括植入颅窗、注射可被大量神经元摄取的荧光钙离子指示剂染料，并最终利用体内双光子显微镜通过时间序列钙成像记录神经元活动。共注射星形胶质细胞特异性染料可将神经元与星形胶质细胞区分开来。该技术也可在特定神经元亚群表达荧光分子的小鼠中实施，以更深入地研究不同细胞群体之间的网络相互作用。
方案
- 配制荧光钙离子指示剂溶液。我们使用乙酰氧基甲酯染料（简称 AM 染料），这类染料在细胞外注射后可被细胞摄取。通常使用浓度为 1 mM 的 Oregon-Green BAPTA-1 AM 或 Fluo-4 AM。AM 染料可从 Invitrogen 公司购得，包装为 50 微克/瓶。首先配制 20% 的 Pluronic F-127 DMSO 溶液，每天使用前加热至澄清。将钙指示剂溶解于 20% Pluronic F-127/DMSO 溶液中，避光孵育 15–20 分钟，使其终浓度为 10 mM。然后将该溶液稀释至 1 mM，稀释液的成分为（单位：mM）：150 NaCl、2.5 KCl、10 Hepes，pH 7.4。此外，通常加入 100 µM Sulforhodamine 101，用于标记星形胶质细胞并在注射过程中可视化移液管。注射前使用 0.49 微米离心滤器对溶液进行过滤（Stosiek et al., 2003；Garaschuk et al., 2006）。
- 在待成像区域上方植入颅窗。我们已经 在 JoVE 中描述了一般方法，但钙染料注射需注意以下修改：
在目标皮层区域制作一个直径为2 mm的较小颅骨开窗，操作时需格外小心，避免损伤下方的硬脑膜。将盖玻片固定于颅骨开窗上方，但仅部分覆盖开窗区域，在开窗边缘与玻璃盖玻片之间留出微小间隙，以便移液管能够以倾斜角度进入皮层。注射前，用牙科水泥在颅骨开窗周围制作一个浅井结构，该浅井应向头端适当延伸，且深度足够浅，以允许微移液管插入进行注射。 - 将小鼠转移至显微镜载物台，并固定头部，如我们所示 血流成像视频.
- 使用拉针仪将玻璃微电极移液管拉制成尖端直径为2-4兆欧电阻的规格。使用微量注射器将钙离子指示剂染料混合物加载到玻璃移液管中。利用显微操作器，在4倍物镜下将微移液管轻柔地降至脑表面，随后在40倍物镜下进行精细定位。选择合适的注射位点，确保上方无或仅有极少血管，以避免影响成像。通过双光子显微镜观察移液管尖端，并缓慢将其推进至硬脑膜下约200微米的皮层深度。然后使用Picospritzer以10 psi压力注射染料混合物1分钟。通常进行2至4次AM钙指示剂染料混合物的注射，各注射点之间空间间隔约200-300微米。这种略微重叠的大体积加载方式可确保约600 × 600微米范围的区域被充分染色，适用于钙成像。注射AM染料混合物后1小时开始成像，以允许染料充分扩散并被神经元摄取。
关键词：玻璃微电极移液管，钙离子指示剂，AM染料，双光子显微镜，压力注射，Picospritzer，皮层成像，神经元活动，钙成像，微量注射
- 使用自制的双光子显微镜进行活体双光子成像，该系统配备Chameleon钛宝石激光器（调谐至800–880 nm）和Cambridge Technology公司生产的检流计镜。图像采集采用Karel Svoboda实验室开发的ScanImage软件（Pologruto等，2003）。样品处的激光功率通常远低于70 mW。全视野图像使用Olympus 20倍（0.95 NA）或40倍（0.8 NA）物镜获取，成像速度为每秒1.95至15.63帧（分辨率从512 × 256像素到256 × 64像素）。线扫描以500 Hz频率采集。成像过程中，动物维持在低浓度异氟烷麻醉（0.6%–0.9%）状态下，并使用Harvard Apparatus公司生产的温控装置保持体温在37°C。操作中需尽量使动物呼吸频率接近每分钟100次。该麻醉水平为能够固定动物体位的最低剂量，同时仍允许记录自发神经活动。
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讨论
与电生理记录相比，该方法的优势在于侵入性更小，能够记录密集神经元网络中的活动。进行此操作时，需特别注意在实施开颅手术时应格外小心，避免损伤硬脑膜。即使少量的硬膜下出血也会严重干扰成像效果。
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致谢
我们感谢 Olga Garaschuk 在优化钙指示剂批量负载方面的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green BAPTA1-AM | 试剂 | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | 试剂 | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | 试剂 | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | 试剂 | Invitrogen | P-3000MP | |
| 离心滤膜（0.45 微米） | 试剂 | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
参考文献
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
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