Summary
要了解在大脑皮层的微型网络的动态，这是必不可少的，同时记录了大量的神经元活动。在活体双光子钙成像是唯一的方法，允许一个记录密集的人口与单细胞的分辨率神经元活动。
Abstract
要了解在大脑皮层的微型网络的动态，这是必不可少的，同时记录了大量的神经元活动。在活体双光子钙成像是唯一的方法，允许一个记录密集的人口与单细胞的分辨率神经元活动。该方法包括在植入颅成像窗口，可以采取由大量的神经元，最后录制的神经元在体内的双光子显微镜使用时间的推移钙成像活动注入了荧光钙指示剂。星形胶质细胞特异性染料合作注入允许一个有别于星形胶质细胞神经元。该技术可以进行小鼠中表达的荧光分子在特定的神经元亚群，以便更好地了解不同的细胞群体的网络交互。
Protocol
- 准备的荧光钙指示剂。我们使用acetoxymethyl酯的染料，或AM短染料。这些染料注射细胞外时，可采取由细胞。我们通常使用浓度为1毫米俄勒冈绿BAPTA - 1 AM或荧光凌晨4点。上午染料可从Invitrogen公司在50微克小瓶。首先，我们准备在20％DMSO聚醚F - 127的解决方案。我们热烈的解决方案之前，每天使用，直到其明确的。我们溶解的钙指标的20％为15-20分钟到10毫米的浓度聚醚F-127/DMSO。然后，我们到1mm的解决方案中包含的解决方案，在MM稀：150氯化钠，2.5氯化钾，10 HEPES，pH值7.4。此外，100微米Sulforhodamine 101通常包括标签星形胶质细胞和可视化在注射移液器。我们过滤解决在注射之前，用0.49微米的离心式过滤器（Stosiek等，2003; Garaschuk等，2006）。
- 在成像区域植入颅窗口。我们所描述的朱庇特的一般方法 ，但重要的钙染料注射以下修改：
请在对利益的皮层区域的直径为2毫米的小开颅手术，采取极端小心不要损坏底层的硬脑膜。安全在开颅手术的地方盖玻片，但只有部分覆盖的开颅手术，留下开颅手术的边缘和玻璃盖玻片之间的一个小的差距，让吸管斜刺进入皮层的空间。注射前，与周围的开颅手术的牙科水泥一个浅水井。以及应延长为喙方向和浅，足以让插入的微量注射。 - 显微镜的阶段转移到鼠标传输和固定头部，在我们的视频血流成像 。
- 拉玻璃微电极吸液管产生2-4兆欧姆电阻，用吸管拉拔到尖端直径。负载上的玻璃吸管的钙指示剂混合使用一个microsyringe。使用显微操作，轻轻地放下上使用4X的目标，然后精细下一个40倍的目标定位大脑表面的微量。选择一个合适的注射位置，有很少或根本没有覆血管成像模糊不清。利用双光子显微镜，吸管尖是可视化和先进慢慢进入皮层，到200微米以下硬脑膜的深度。然后，压力10 PSI为1分钟，利用一个Picospritzer注入的染料混合物。我们通常会提供两到四个AM钙染料混合注射约200-300微米，在空间上分开。这略微重叠注射批量装载方法，确保有足够的钙成像染色，面积为600 × 600微米大。 1小时后开始注入上午染料混合物的成像，使染料扩散和采取由神经元。
- 执行自定义的双光子成像在体内双光子显微镜使用变色龙钛蓝宝石激光器（调整到800-880纳米）和剑桥科技振镜。我们获取的图像，使用ScanImage卡雷尔斯沃博达的实验室（Pologruto等，2003）开发的软件。激光功率通常远低于70兆瓦的样本。整场图像采集使用（0.95 NA）的20倍或40倍（0.8 NA）的奥林巴斯的目标，在1.95-15.63帧每秒（512 × 256像素到256 × 64像素）。线扫描获得的在500赫兹。在成像，动物保持光异氟醚麻醉（0.6-0.9％），也保持在37℃用一个哈佛仪器的温度控制装置。护理是保持动物的呼吸频率为100次/分钟尽可能接近。这种使用的麻醉水平是最低水平，无法移动的动物，但仍允许自发活动予以记录。
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Discussion
电生理记录，这种方法的优势在于它是创伤小，允许在密集的神经元的神经网络活动的录音。执行此过程时，重要的是要记得拿时要格外小心执行了开颅手术，不损伤硬脑膜。即使是少量硬膜下出血，大大模糊的影像。
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Acknowledgments
我们要感谢奥尔加Garaschuk有益的讨论，优化大容量装载的钙指标。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
