Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Résumé

Cette vidéo montre la technique de microinjection dans la gonade de C. elegans pour créer des animaux transgéniques.

Résumé

Caenorhabditis elegans transgéniques peuvent être facilement créées via la micro-injection d'une solution d'ADN plasmidique dans ^l'une des gonades. L'ADN plasmidique réorganise pour former concatémères extrachromosomique qui sont héritées de façon stable, mais pas avec la même efficacité que les chromosomes réelle ^2. Un gène d'intérêt est co-injecté avec un marqueur évident phénotypiques, comme rol-6 ou GFP, pour permettre la sélection d'animaux transgéniques sous un microscope à dissection. Le gène exogène peut être exprimée à partir de son promoteur natif pour les études de localisation cellulaire. Alternativement, le transgène peut être piloté par un promoteur différent tissu-spécifique d'évaluer le rôle du produit du gène dans la cellule ou un tissu particulier. Cette technique entraîne efficacement l'expression des gènes dans tous les tissus de C. elegans à l'exception des cellules germinales de l'embryon ou au début ^3. Création d'animaux transgéniques est largement utilisé pour une gamme de paradigmes expérimentaux. Cette vidéo montre la procédure de micro-injection pour produire des vers transgéniques. Par ailleurs, la sélection et le maintien de lignées transgéniques stables C. elegans est décrite.

Protocole

Construction plasmide d'expression

Deux plasmides sont nécessaires: un pour expression tissu-spécifique du gène d'intérêt et d'une seconde comme marqueur de la transformation sélectionnable.

Experimental plasmidique

1. Sélectionnez un promoteur qui est exprimé dans le type de tissu / cellule d'intérêt, par exemple, un nerf ou de muscle promoteur spécifique. Si l'on est d'exprimer des gènes multiples dans le même tissu, une cassette promoteur plasmide dans le système Gateway (Invitrogen) peuvent être utilisés. Cette approche permet l'insertion d'un gène d'intérêt en aval....

Discussion

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de:
- Injecter directement dans le centre de la gonade
- Ne pas injecter trop de liquide
- Travailler rapidement pour empêcher la dessication.

Si vous rencontrez des problèmes avec l'aiguille, comme elle est cassée trop grand, il est préférable de refaire une aiguille neuve, plutôt que d'essayer d'injecter avec une aiguille de moins idéale.

La génération des vers transgéniques a de nombreuses applications telles que:

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Huile d'halocarbone, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Lame de couverture 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Lame de couverture 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Lame de couverture 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
Capillaire de 100 µl		VWR international	53432-921
Capillaire en verre pour aiguilles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Tire-à-aiguilles	Outil	Narishige International	Modèle PP-830
Système microINJECTOR		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Microscope, Plateau, Manipulateur
Dissection, avec fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissection	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645