이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.
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이 논문에서
요약
초록
여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브, 체절과 심장 primordia 형성에 유전자 발현을 연구를위한 이상적인 도구가합니다. 이 비디오는 현장 하이브리드화 2 색 전체 마운트에있는 다른 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 난자에서 해부하고 paraformaldehyde에서 해결되었습니다. 둘째, 배아는 prehybridization에 대한 처리됩니다. 배아는 다음 두 가지 프로브, 팔 결합 하나와 FITC에 결합하여 하나 hybridized입니다. 하룻밤 하이브리드화 다음, 배 (胚)가 발굴 결합 항체와 incubated입니다. 발굴 기판에 대한 컬러 반응이 수행하고, 관심 지역은 파란색으로 나타납니다. 배아는 다음 FITC 항체와 결합 incubated입니다. 배아는 FITC와 색상 반응을 처리하고, 관심 지역은 빨간색으로 나타납니다. 마지막으로, 배아는 고정 및 처리 phtograph과 sectioning입니다. 문제 해결 가이드도 제공됩니다.
프로토콜
1 부 : 배아를 고정
- 얼음 추위 depc - PBS로 해부 접시를 채우십시오. 얼음 계속. 포셉로 껍질을 감청하여 계란을 열고 조개 조각을 제거합니다.
- 포셉과 알부민 두꺼운 제거합니다. 그 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉과 난황을 기울이기.
- 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라.
- 숟가락 사용, 얼음 추위 depc - PBS에 노른자와 장소에서 배아를 제거합니다.
- 현미경, 세포막과 노른자를 제거하고 고정 요리로 전송할 수 있습니다.
- 아래로 핀 depc - PBS를 제거합니다. depc - PBS에서 4% PFA로 교체하고 4 O / N를 수정 ° C.
- 정착액 제거합니다. 얼음 추위 depc - PBS로 바꿉니다. 뭉툭한 끝 microcapillary 바늘이나 microdissection 나이프를 이용하여 프로브의 트래핑을 방지하기 위해, 신경계와 심장 충치 구멍.
- 0.1 % 트윈 - 20 (PBT)를 2 배 10 MN depc - PBS 씻으십시오. 25 %, 50 %, PBT의 75 % 메탄올의 각 10 MN을 탈수. 100 % 메탄올 두 번 배아를 탈수. 메탄올에서 -20 ° C에 보관하십시오.
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토론
현장 하이브리드화 방식의 2 색 전체 마운트는 관심 중 하나 또는 두 개의 유전자를 사용하여 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴 모두를 결정하는 데 사용됩니다. 응용 프로그램은 새로운 유전자의 유전자 발현 패턴의 평가 (예 : 1,2,뿐만 아니라 유전자 발현 다음과 모욕의 변화 (배아 조작 3, 구슬 4 및 RNA 또는 DNA의 electroporation 5 구성)을 포함합니다.
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공개 사항
저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 난자 | 동물 | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| 실체현미경 | 현미경 | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh 자동 배양기 | 도구 | Lyon | RX | |
| 하이브리다이제이션 배양기 | 도구 | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator 궤도 혼합기 | 도구 | Fisher Scientific | 14-062 | |
| 곡선 핀셋 (1) | 도구 | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| 미세 가위 | 도구 | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 스푼 | 도구 | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| 파스퇴르 모세관 피펫 | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| 마이크로 모세관 튜브 | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | 수직 마이크로피펫 풀러를 사용하여 당기고, 미세 핀셋으로 끝을 뭉툭하게 처리함 | |
| 마이크로 해부 칼 | Fine Science Tools | 10056-12 | in situ 하이브리다이제이션 전강에 구멍을 뚫는 데 사용 | |
| Minuten 핀 (직경 0.2mm) | Fine Science Tools | 26002-20 | 마그네틱 스터러를 사용하여 핀을 함께 보관함 | |
| Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 경화제 및 베이스 | 시약 | Dow Corning | 0001986475 | 경화제 1분량과 베이스 9분량을 혼합하여 37°C에서 밤새 굳힘 |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | 시약 | Acros Organics | 10025025 | PBS 1L에 depc 1mL를 첨가하고 흔든 후 오토클레이브 처리함 |
| 16% PFA | 시약 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | 시약 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | depc-H₂O에서 10 mg/mL 농도로 조제하여 10µL씩 분주함. -20°C에서 보관함. | |
| 탈이온 포름아미드 | 시약 | Ambion | 9342 | |
| 효모 tRNA-25 mg | 시약 | Invitrogen | 15401-011 | depc-H₂O에서 20 mg/mL 농도로 조제하여 125µL씩 분주함. -20°C에서 보관함 |
| 헤파린 나트륨염 | 시약 | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | depc-H₂O에서 50 mg/mL 농도로 조제하여 100µL씩 분주함. -20°C에서 보관함. |
| SSC x20 pH5.5 | 시약 | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | 시약 | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| 말레산 | 시약 | Fluka | 63189 | |
| B–hringer 블로킹 시약 | 시약 | Roche Group | 11096176001 | MABT 내에서 2% 농도로 사용. 제조 시 MABT와 함께 60°C에서 20분간 가열함. 스톡을 만들어 1-5 mL씩 분주하여 20°C에서 보관 가능함. |
| 열 불활성화 양 혈청 | 시약 | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | H₂O 10 mL에 녹여 55°C에서 30분간 가열함. 1mL씩 분주하여 -20°C에서 보관함. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab 단편 | 시약 | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP 스톡 용액 | 시약 | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab 단편 | 시약 | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red 알칼리성 포스파타아제 기질 키트 | 시약 | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | 시약 | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | 후드 내에서 사용 |
참고문헌
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C.
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