Un metodo semplice e specifico è stato dimostrato per la marcatura fluorescente e la rilevazione maggiore di proteine di superficie cellulare, senza un passo di frazionamento. Abbondanza differenziale di proteine della superficie cellulare è stato analizzato mediante elettroforesi bidimensionale (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.
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Articolo metodologico
Etichettatura selettiva di proteine della superficie cellulare utilizzando CyDye DIGE Coloranti Fluor Minimal
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteine di superficie sono fondamentali per la capacità della cellula di reagire al suo ambiente e di interagire con le cellule vicine. Essi sono noti per essere induttori di quasi tutti i segnali intracellulari. Inoltre, essi svolgono un ruolo importante nell'adattamento ambientale e trattamento farmacologico, e spesso sono coinvolti nella patogenesi della malattia e patologia (1). Interazioni proteina-proteina sono intrinseche vie di segnalazione, e per ottenere un quadro più chiaro in questi complessi processi biologici, metodi sensibili e affidabili sono necessari per lo studio delle proteine di superficie delle cellule. Bidimensionale (2-D) elettroforesi è ampiamente utilizzato per il rilevamento dei biomarcatori e altri obiettivi in campioni di proteine complesse per studiare i cambiamenti differenziale. Proteine di superficie cellulare, in parte a causa della loro abbondanza basso (1 2% di proteine cellulari), sono difficili da individuare in un 2-D gel senza frazionamento o qualche altro tipo di arricchimento. Sono anche spesso poco rappresentati in 2-D gel a causa della loro natura idrofobica e ad alto peso molecolare (2). In questo studio, presentiamo un nuovo protocollo per le cellule intatte mediante CyDye DIGE coloranti Fluor minimi specifici per l'etichettatura e la rilevazione di questo importante gruppo di proteine. I risultati hanno mostrato specifici dell'etichettatura di un gran numero di proteine di superficie delle cellule con l'etichettatura minimo di proteine intracellulari. Questo protocollo è rapido, semplice da usare, e tutti CyDye tre DIGE coloranti Fluor minima (Cy 2, 3 e Cy Cy 5) può essere usato per etichettare superficie cellulare delle proteine. Queste caratteristiche consentono di multiplexing utilizzando il 2-D elettroforesi su gel a fluorescenza Differenza (2-D DIGE) con tecnologia DIGE Ettan e l'analisi dei cambiamenti dell'espressione proteica con DeCyder 2-D Software differenziale di analisi. Il livello di superficie cellulare delle proteine è stato seguito durante il digiuno nel siero di cellule CHO per varie lunghezze di tempo (vedi tabella 1). Piccoli cambiamenti in abbondanza sono stati rilevati con elevata precisione, ed i risultati sono supportati da definire metodi statistici.
Protocollo
Coltura cellulare
- Crescere le cellule ovariche di criceto cinese (CHO-K1) utilizzando le procedure standard di coltura cellulare in F-12 di media Ham con GlutaMAX ho contenente il 10% di siero fetale bovino, 50 U / ml di penicillina, e 50 mg / ml di streptomicina solfato (Invitrogen).
- Scambio terreno di coltura di siero di supporti liberi. Etichetta proteine di superficie della cellula erano in diversi momenti con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 coloranti minima (vedi cellulare Etichettatura sezione di superficie, sotto).
- Un numero uguale di cellule piscina da ogni punto di tempo e l'etichetta con CyDye DIGE Fluor Cy2....
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Discussione
Concentrazione di proteine
Una panoramica dei due flussi di lavoro di etichettatura è illustrato nella figura 1. Dal momento che le cellule sono ancora intatte quando etichettati secondo la superficie cellulare protocollo proteina etichettatura, solo le proteine della superficie cellulare sono esposti al colorante. Nello standard Ettan DIGE protocollo, le cellule sono lisate prima di etichettatura e di proteine all'interno e all'esterno della cellula sono etichettati (Fig. 1). La q.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo il professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer e Sigurd Krieger presso l'Istituto di Patologia Clinica, Università di Vienna, in Austria per la collaborazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Kit CyDye DIGE, 2 nmol | Reagente | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| Kit 2-D Quant | Reagente | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Tampone IPG pH 3-11NL | Reagente | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Striscia secca Immobiline pH 3-11NL, 24 cm | Reagente | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Strumento | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| Kit IPGbox | Strumento | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| Soluzione di riallontanamento DeStreak | Reagente | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Fluido di copertura per striscia secca Immobiline | Reagente | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Unità Ettan IPGphor 3 IEF | Strumento | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Manifold Ettan IPGphor | Componente dello strumento | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Stampo per gel Ettan DALTtwelve | Strumento | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Unità di separazione Ettan DALTtwelve e alimentatore/comando | Strumento | GE Healthcare | 80-6466-46 | Unità 230 V: 80-6466-27 |
| Imager a modalità variabile Typhoon 9410 | Strumento | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Strumento | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Strumento | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Strumento | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Strumento | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| Software di analisi differenziale 2-D DeCyder | Altro | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| Software di analisi ImageQuant | Altro | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagente | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagente | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| Ditiotreitolo (DTT) PlusOne | Reagente | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Blu di bromofenolo | Reagente | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagente | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Dodecilsolfato di sodio (SDS) | Reagente | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| Glicerolo 87% PlusOne | Reagente | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| ReadySol IEF 40% T, 3% C PlusOne | Reagente | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| TEMED PlusOne | Reagente | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| Persolfato di ammonio PlusOne | Reagente | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| Glicina PlusOne | Reagente | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| Preparazione campioni 2-D per proteine di membrana | Reagente | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Solfato di streptomicina | Reagente | Invitrogen | 15140-122 |
Riferimenti
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem.
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Ristampe e permessi
