Summary
هنا نقدم وسيلة لعزل الخلايا العصبية والثقافة الخلايا الحبيبية والخلايا العصبية للدماغ السلف الحبيبية للدماغ الفأر من بعد الولادة.
Abstract
قشرة المخيخ هو بنية صفها جيدا أن يوفر فرصا فريدة لدراسة خصائص الخلايا العصبية و1،2 التنمية. من أنواع الخلايا العصبية للدماغ (الخلايا الحبيبية ، وخلايا بركينيي interneurons المثبطة) ، حبيبة الخلايا العصبية هي الآن الأكثر عددا والأكثر وفرة في نوع من الخلايا العصبية في المخ لدى الثدييات. في القوارض ، يتم إنشاء الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ أثناء الأسابيع الأولى بعد الولادة اثنين من الخلايا الاصلية في الطبقة الخارجية للقشرة المخيخ ، وطبقة خارجية الحبيبية (EGL). بروتوكول المعروضة هنا يصف التقنيات لإثراء ثقافة والخلايا العصبية والخلايا الحبيبية السلف الخاصة بهم من المخيخ الماوس ما بعد الولادة. سنقوم بشرح الإجراءات للحصول على ثقافات زيادة 3،4 نقاء ، والتي يمكن استخدامها لدراسة تمايز تكاثر الخلايا الاصلية الى خلايا عصبية 5،6 الحبيبية. مرة واحدة في الخلايا الاصلية تفرق ، وتوفر أيضا ثقافات السكان متجانسة من الخلايا العصبية الحبيبية للتلاعب التجريبية وتوصيف الظواهر مثل synaptogenesis ، الغلوتامات وظيفة مستقبلات 7 ، والتفاعل مع الخلايا الأخرى مخيخي المنقى 8،9 أو موت الخلية 7.
Protocol
الجزء 1 : إعداد (1-2 أيام قبل تشريح) (لا يظهر على الفيديو)
- تحضير الحلول الثقافة والإعلام :
- CMF - 4X PBS - EDTA (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من الفوسفات مخزنة المالحة EDTA لالتخفيفات Percoll) : للتر الواحد ، إضافة 32 غرام كلوريد الصوديوم ، 1.2 غرام بوكل ، 8 ز الجلوكوز ، 2 غ ناه 2 ص 4 ، 1 غرام KH 2 PO 4 ، 8 ٪ 2 مل الأسهم NaHCO 3 ، 10 مل EDTA 1M (8.0 درجة الحموضة) إلى المقطر / منزوع الأيونات الماء. ضبط مستوى الصوت إلى 1 ليتر ، والرقم الهيدروجيني إلى 7.4. فلتر تعقيم.
- HBSS الغلوكوز : الغلوكوز إضافة (6 جرام / لتر) إلى الكالسيوم والمغنيسيوم في محلول ملح مجانا هانك الرصيد (HBSS) وتصفية العقيمة. ويمكن تخزين 500 مل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل الى شهر.
- الإعلام الثقافة : مصل خالية المتوسطة (SFM) و 10 ٪ FBS المتوسط. إلى 48 مل من Neurobasal A - 500 متوسطة إضافة ميكرولتر 100X GlutaMAX الأول ، 500 - 100X ميكرولتر البنسلين الستبرتوميسين (نهائي 100 وحدة بنسلين و 100 ميكروغرام الستربتوميسين) ، 6.25 م 2 ميكرولتر بوكل (250 ميكرومتر النهائي). انقسام في aliquots 2 من 9 مل و 40 مل. للتحضير 10 ٪ FBS المتوسطة ، إضافة لارتفاع درجات الحرارة 1ml FBS المعطل للقسامة مل 9. لإعداد SFM ، إضافة 800 ميكرولتر من الملحق المصل خالية B - 27 الى 40 مل قسامة. تصفية وتعقيم المحل في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها 2 أسابيع. للحصول على أفضل النتائج جعل وسائل الإعلام لكل تجربة جديدة.
- تحضير التخفيفات PERCOLL :
- ويتم تزويد Percoll كسائل ويجب أن يحمض قبل استخدامها. لتحضير الأوراق المالية ، إضافة حمض الهيدروكلوريك 1N شيئا فشيئا إلى حل Percoll خلال فترة 1-2 ساعة حتى يتم التوصل إلى الرقم الهيدروجيني 7.4. مضيفا ان حمض الهيدروكلوريك بسرعة كبيرة يؤدي إلى Percoll الكلي. وهناك حاجة إلى ما يقرب من حمض الهيدروكلوريك 6.5ml 1N عن كل ليتر من Percoll. تصفية وتعقيم المحل في 4 درجات مئوية.
- وسوف تستخدم في تخفيف Percoll الخطوة التدرج Percoll : A 35 ٪ و 60 ٪ (المجلد المجلد). تحضير 100 مل تحتوي على التخفيفات Percoll 35 أو 60 مل من الأسهم Percoll ، 25 مل من CMF - 4X PBS - EDTA والمقطر / منزوع الأيونات H2O إلى حجم النهائية. إضافة بضع قطرات من زرقة الطولويدين في حل 60 ٪ ، بل سيساعد على تصور واجهة والخلايا. تصفية وتعقيم المحل في 4 درجات مئوية.
- CMF - 4X ينبغي PBS - EDTA لا يكون مضى عليها أكثر من 3 أشهر ، وعدم كفاية التخزين المؤقت سوف يسبب زيادة موت الخلايا أثناء العملية.
- تغسل coverslips زجاج (إذا كان أفضل من ولاية كارولينا شركة التموين البيولوجي) مع حمض الهيدروكلوريك 10 ٪ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع هيجان خفيفة ، تشطف جيدا مع المقطر / deonized المياه وتخزينها في الايثانول 70 ٪ : COVERSLIPS الاستعداد. قبل الاستخدام ، هي واحدة coverslips اللهب تعقيمها لفترة وجيزة من خلال عقد لهم مع ملقط على لهب مكشوف (بنسن الموقد) حتى يتبخر الإيثانول. يمكن وضعها coverslips الزجاج 12 ملم في لوحات ثقافة 4 - جيدا وcoverslips 25 ملم في لوحات ثقافة 6 - جيدا.
- سفن الثقافة طلاء مع الركيزة : للحصول على تلوين المناعي أو coverslips المخدرات الزجاج علاجات أكثر ملاءمة حيث يمكن بسهولة أنها شنت على شرائح زجاجية للرؤية تحت المجهر. عندما تكون هناك حاجة أعداد كبيرة من الخلايا لجمع عينات من الحمض النووي الريبي أو البروتينات ، يمكن أن يكون مثقف ثقافة الخلايا على البلاستيك ليلة dishes.The قبل التشريح ، يجب أن تكون مغلفة coverslips الزجاج أو الصحون البلاستيكية للثقافة مع بولي - D - يسين (500 ميكروغرام / مل ؛ 800 ميكرولتر / 6 جيدا لوحات جيدا أو 350 ميكرولتر / 4 - جيدا لوحات جيدا). يتم تخزين 5 ملغ / مل حل سهم بولي - D - يسين في -20 درجة مئوية ، ثم المخفف في الماء المقطر / deonized عقيم وعقيمة حق تصفيته قبل الاستعمال. يتم تحضين السفن الثقافة في 37 درجة مئوية خلال الليل (أو على الأقل لمدة 2 ساعة قبل الطلاء) وغسلها مرتين مع الماء المقطر المعقم الحق / deonized قبل الطلاء.
- إعداد أطباق PREPLATING : سيتم استخدام هذه الأطباق لمرحلة ما قبل طلاء الخلايا المعزولة مخيخي قبل الثقافة لإزالة الملوثات الدبقية ، والتي تلتزم أيسر إلى انخفاض تركيز الركيزة. معطف two 60 ملم الأطباق ثقافة البلاستيك مع 4 لتر لكل طبق من بولي - D - يسين (100 ميكروغرام / مل ؛ ملاحظة هذا هو 1 / 5 من التركيز المستخدمة لزراعة). احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل (أو على الأقل لمدة 2 ساعة قبل تشريح). الحق قبل التشريح ، وإزالة الحل بولي - D - يسين ، وغسل الأطباق مرتين مع الماء المعقم والسماح ليجف في غطاء محرك السيارة.
- تعقيم أدوات تشريح في الأوتوكلاف أو في اليوم التشريح ، غمر الأدوات في الايثانول 70 ٪ لمدة 20 دقيقة. الأدوات المطلوبة : مقص Permaset ، مقص microdissecting ، وأربعة دومون # 5 ملقط تشريح.
الجزء 2 : الاستعداد للتشريح (يوم تشريح) -- (أظهر في الفيديو)
يتم تنفيذ كافة الإجراءات التالية في نسيج الثقافة هود ما لم يذكر.
- مسح أسفل منطقة تشريح مع الايثانول 70 ٪. دافئ وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي أو في 5 ٪ CO 2 37 حاضنة درجة مئوية.
- عند بدء تشغيل النظام الجديد غراء التفكك كيت (رثينجتون) ، وإعداد حل الألبومين ovomucoid المانع. إضافة 32 ملمن EBSS (محلول ملح وايرل المتوازن ؛ المقدمة في المجموعة) إلى خليط المانع الألبومين ovomucoid والسماح محتويات بحل أثناء إعداد المكونات الأخرى. إعادة تشكيل لاستخدام أولا ، ثم تخزين الحل المتبقية في 2-8 درجة مئوية ، واستخدامها حتى يتم الانتهاء من العزلة five المسموح به من قبل كل مجموعة.
- إضافة 5 مل من القارورة إلى EBSS غراء واحد من عدة التفكك (القنينة الواحدة كافية لتفكك 4-15 مخيخات من الفئران بعد الولادة 5 أيام). ضع قارورة غراء في 5 ٪ CO 2 37 درجة مئوية أو حاضنة 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 5 إلى 10 دقائق حتى يذوب تماما غراء والحل يبدو واضحا. الحفاظ على الحل في درجة حرارة الغرفة أثناء تشريح.
- إضافة 500 ميكرولتر من قنينة الدناز EBSS إلى واحد من عدة التفكك. المزيج بلطف من خلال الاستفادة من قنينة منذ الدناز حساسة للتمسخ القص. إضافة 250 ميكرولتر من حل لهذه القارورة التي تحتوي على غراء (تركيز النهائي هو 20 وحدة / مل وغراء الدناز 0.005 ٪). حفظ القارورة الدناز المتبقية لاستخدامها في الخطوة 5.1 أو 6.1.
الجزء 3 : تشريح وإزالة السحايا
- سن المثلى لزراعة الخلايا الحبيبية من الفئران C57BL/6J هو يوم بعد الولادة 4-6 ، عندما يكون عدد الخلايا الحبيبية الأسلاف في EGL peaks1 ، 10. تشريح الجراء في وقت واحد ، وكما كنت أصبحت أكثر ألفة مع تشريح دماغ محاولة تقليل وقت التشريح إلى ما لا يزيد عن 6 دقائق لكل الجرو. السرعة هي جوهر المسألة.
إذا كانت الخطوة التدرج Percoll يتم تجاوز ، يمكن eight الجراء الماوس يوما بعد الولادة - 5 العائد خلايا كافية لمدة 6 لوحة الثقافة جيدا (أو ستة coverslips 25 ملم) أو لمدة ست لوحات ثقافة 4 - جيدا (أو 24 12 -- coverslips ملم). العائد التقريبي هو 4 إلى 5x106 الخلايا في كثافة الجرو والطلاء يمكن أن تتراوح بين 1 و 5X105 cells/cm2. لأن فقدان خلايا 15-20 ٪ خلال step4 Percoll ، هناك حاجة إلى مزيد من الحيوانات للحصول على نفس كثافة الخلية المطلوبة. - ماصة 15 مل من الجلوكوز HBSS الى 60 ملم بلاستيك نسيج الثقافة وطبق في 10 مل العقيمة فالكون 15 مل أنبوب من البلاستيك مخروطي. وضعت على الجليد.
- خارج الغطاء ، مسح الرأس من الجرو مع الايثانول 70 ٪. استخدام مقص لقطع رأس Permaset الجرو. (لن يكون قطع الرأس يظهر في شريط الفيديو).
- في هود ، والاستمرار على الرأس مع ملقط دومون بحيث يمكنك أن ترى بوضوح الجزء الخلفي من الجمجمة. الوصول إلى المخ عن طريق إدراج مقص microdissecting في ماغنوم الثقبة وقطع مستقيم نحو العينين. باستخدام الملقط ، بعيدا قشر الجلد وترفع لفضح الجمجمة الدماغ. باستخدام الملقط دومون ، قرصة قبالة المخيخ والدماغ المتوسط المحيطة بها ، وتحويلها إلى الطبق مع الغلوكوز HBSS. (فمن الأسهل للتلاعب في المخيخ وإزالة السحايا إذا لا تزال تعلق المخيخ إلى الأنسجة المحيطة).
- تشريح تحت المجهر ، بلطف قشر السحايا قبالة المخيخ ، وكذلك بين الفصوص واحد غرامة ملقط # 5 دومون أثناء استخدام الملقط أخرى لترسيخ أسفل المخيخ إلى اللوحة. ستلاحظ الأوعية الدموية على سطح المخيخ. هذه الأوعية الدموية هي وسيلة جيدة للتعرف على السحايا. إزالة السحايا حتى المخيخ يأخذ على مظهر بيضاء متعقد. فصل المخيخ من بقية الدماغ المتوسط. تحويلها الى جانبها البطنية وإزالة الضفيرة المشيمية ، الذي يشبه الشريط المحمر بين المخيخ والدماغ المتوسط بطني المجاورة. كل مكان في المخيخ الباردة HBSS الغلوكوز في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد في أقرب وقت كما شرحت. التغيير هو الحل لتشريح جديدة HBSS الغلوكوز بعد تشريح أدمغة 3.
الجزء 4 : تعليق خلية
- حالما يتم الانتهاء من جميع التشريح ، إزالة HBSS الغلوكوز من الأنبوب واستبدالها الحل غراء في الخطوة 2.4. على الرغم من أن توصي مجموعة قطع الأنسجة في قطع صغيرة ، نجد أنه ليس من الضروري خفض أو اللحم المفروم ومخيخات في هذا العمر. وضع حل الأنسجة غراء + (في أنبوب 15 مل المخروطية) في 37 درجة مئوية حمام مائي أو 5 ٪ CO 2 37 درجة مئوية لمدة 15 حاضنة إلى 20 دقيقة. ل4-8 مخيخات و 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية غير كاف ؛ لعدد أكبر من مخيخات 20 إلى 30 دقيقة هي الأفضل. تستنهض الهمم بلطف أنبوب كل دقيقة 3-4.
- متمزج المخلوط مع تلميح ماصة معقمة P1000 الهباء الجوي التي تم المغلفة مع FBS. القيام بهذه الخطوة بلطف لمنع أي تشكيل فقاعة الهواء. ويمكن استخدام ماصات النار الزجاج المصقول ، لكننا نجد أن المصل نصائح مغلفة معقمة الهباء P1000 العمل فقط كذلك. إلى معطف غيض مع FBS ماصة ، ماصة FBS صعودا وهبوطا مرتين فقط قبل الاستخدام. حوالي 10 صعودا وهبوطا مع الحركات ماصة تكفي لفصل الأنسجة. فإن الحل يصبح غائما. السماح للتعليق على الجلوس لمدة 30-60 ثانية بحيث أن أي قطعة كبيرة من الأنسجة undissociated سوف تستقر في قاع الأنبوب.
- إزالة الخلايا المعلقة (الحرص على عدم إزالة قطعة نسيج undissociated في بottom) في أنبوب جديد 15 مل المخروطية مع طرف الماصة المغلفة المصل. الطرد المركزي في 200xg تقريبا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إعداد إعادة تعليق المتوسط. للقيام بذلك ، مزيج من 2.7 مل EBSS مع 300 ميكرولتر من إعادة حل المانع الألبومين ovomucoid في أنبوب العقيمة. إضافة 150 ميكرولتر من محلول الدناز من الخطوة 2.4.
- بعد الطرد المركزي ، وتجاهل resuspend طاف بيليه على الفور خلية في الدناز المخفف / الزلال حل المانع أعدت في الخطوة 4.3 مع المصل المغلفة تلميح P1000 ماصة الهباء الجوي.
- إعداد التدرج الكثافة متقطعة على النحو التالي. إضافة 5 مل من محلول الألبومين ovomucoid مثبط لأنبوب مخروطي 15 مل. تعليق بعناية طبقة الخلايا على القمة. الطرد المركزي في 70xg تقريبا لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. فصل الخلايا بيليه في أسفل الأنبوب ، شظايا غشاء البقاء في الواجهة.
- إذا كنت ترغب في الحصول على الثقافات التي أثرت في الخلايا الحبيبية ، تجاوز الفصل المتدرج Percoll الخطوة (التي تعطي الثقافات أنقى من الخلايا الحبيبية للدماغ) ، والشروع في الجزء 6. إذا كنت ترغب في مزيد من عزل الخلايا الحبيبية من الدبق وinterneurons كبير Percoll الفصل المتدرج ، انتقل إلى الجزء 5. سيتم استخدام هذه الخطوة من حيث التدرج Percoll خفض العائد من الخلايا. في أيدينا ، وخفض في الغلة ما يقرب من 20-35 ٪. ومع ذلك ، هناك زيادة في تخصيب اليورانيوم من الخلايا العصبية والخلايا الحبيبية من السلف ما يقرب من 90 ٪ إلى 95-99 ٪.
الجزء 5 : Percoll الفصل المتدرج
- تجاهل وطاف resuspend فورا بيليه في 2 مل من الجلوكوز HBSS مع 50 ميكرولتر من الدناز من الخطوة 2.4. تعليق تصفية خلية الرغم من شبكة من النايلون (حجم المسام 70 ميكرون) عن طريق الجاذبية. وهذه الخطوة الكبيرة إزالة الخلايا غير العصبية ، وينص على تعليق خلية واحدة أفضل.
- يعد اطلاق قذائف زجاج مصقول ماصات باستور. للقيام بذلك ، بلطف اللهب غيض من ماصة الزجاج حتى يتم مملس حافة وتتحمل ماصة هو 40-50 ٪ من الحجم الأصلي. الحرص على عدم جعل فتحة صغيرة جدا.
- إعداد Percoll التدرج. المكان 10 مل من محلول Percoll 35 ٪ في أنبوب 50 مل المخروطية العقيمة. يتم تحميل 60 ٪ Percoll (10 مل) في حقنة معقمة 10 مل مع إبرة معقمة الشوكي المرفقة. بلطف طبقة الحل Percoll 60 ٪ تحت حل 35 ٪ ، وذلك بإضافة 60 ٪ الحل في الجزء السفلي من الأنبوب مع ابرة في العمود الفقري. العناية للحفاظ على واجهة حاد بين طبقتين. إضافة خلايا إلى أعلى التدرج باستخدام ماصة النار مصقول ، مضيفا منهم بلطف على طول الجانب من الأنبوب من دون إزعاج للواجهة.
- بعناية وضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 1800xg. المنحدر تصل سرعة خطوة واحدة كل 20 ثانية (سرعة الزيادات هي على النحو التالي : حوالي 18 ، 70 ، 200 ، 440 ، 850 ، 1100 ، 1800xg) بحيث يستغرق حوالي 2 دقيقة للوصول الى السرعة المطلوبة. بدء موقت إلى 10 دقيقة عندما يتم التوصل 1800xg. عند الانتهاء ، وانخفاض سرعة تدريجيا خطوة واحدة كل 20 ثانية.
- إزالة واجهة العلوي من الانحدار (التي تحتوي على الدبقية كبيرة ، وخلايا بركينيي وinterneurons) وتجاهل.
- إزالة الخلايا بعناية في واجهة بين 35 ٪ و 60 ٪ مع Percoll ماصة مصقول النار ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. Resuspend في 3 مجلدات من الغلوكوز HBSS ومزيج من قبل عدة مرات عكس. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1100xg.
- إزالة طاف وإضافة 4 مل من المتوسط FBS 10 ٪ مع 50 ميكرولتر من الدناز. Resuspend الكرية بلطف باستخدام ماصة النار مصقول لتشكيل تعليق خلية واحدة. انتقل إلى الخطوة 6.2.
الجزء 6 : قبل الطلاء والطلاء
- تجاهل وطاف resuspend فورا بيليه في 4 مل من المتوسط FBS 10 ٪ مع 50 ميكرولتر من الدناز من الخطوة 2.4. تعليق تصفية خلية الرغم من شبكة من النايلون (حجم المسام 70 ميكرون) عن طريق الجاذبية. وهذه الخطوة الكبيرة إزالة الخلايا غير العصبية ، وينص على تعليق خلية واحدة أفضل.
- لوحة الخلايا التي جمعت على طبق بولي - D - يسين قبل الطلاء المغلفة لمدة 20 دقيقة في 5 ٪ CO 2 37 درجة مئوية الحاضنة. مع تكرار طبق الطازجة. دبق نجمي الخلايا والخلايا وأثقل تستقر والانضمام إلى الأطباق وتترك الخلايا العصبية وخلايا صغيرة الحبيبات السلف عصبون العائمة. بعد الحضانة ، ويسهل فكها الخلايا العصبية الحبيبية انضمت فضفاضة والخلايا العصبية وخففت السلف مع التنصت لطيف من لوحة.
- جمع الخلايا العصبية والخلايا الحبيبية السلف الخلايا العصبية في أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 200xg لمدة 5 دقائق. Resuspend الكرية في 1 مل من مصل خالية من المتوسط وعدد an قسامة من 10 ميكرولتر باستخدام عدادة الكريات.
- إضافة مصل خالية المتوسطة للوصول إلى كثافة الخلية المطلوبة. مبادئ توجيهية لأرقام تقريبية من الخلايا لوحة لمتوسطة الكثافة : 6 - جيدا لوحات و 3.5 الى 4 ملايين الخلايا ؛ لوحات 4 - جيدا ، 650،000 الخلايا. لمدة 6 - جيدا لوحات والثقافة ، وأنا لوحة 1.5 مل / لمدة 4 بشكل جيد وكذلك جيش التحرير الشعبى الصينى.قسم التدريب والامتحانات ، وأنا لوحة 0.5 مل / أيضا. تتم المحافظة على الخلايا في 5 ٪ CO 2 37 درجة مئوية الحاضنة. تغيير المتوسطة تماما بعد 24 ساعة مع تغييرات لاحقة كل يومين إلى ثلاثة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند هذا البروتوكول على إدخال تعديلات على الإجراءات التي تم وصفها في 3،7،11 الماضية. هناك عدة نقاط هامة لاحظ كما هو مبين أدناه.
الخلايا العصبية والخلايا الحبيبية السلف الالتزام في حدود 2 ساعة من الطلاء. الخلايا السليمة لديها الجولة التشكل تحت المجهر 4 المرحلة التباين. في غضون 24 ساعة بعد والطلاء ، والخلايا السليمة موزعة بالتساوي في جميع أنحاء البئر coverslips أو البلاستيك وسوف تشكل العمليات. في ذلك الوقت للتغيير المتوسطة الأولى ، بعد 24 ساعة ، سيكون هناك عدد قليل من خلايا ميتة طافية. هذا أمر طبيعي ، وخلايا قليلة سوف تموت أو تصبح غير صحية أثناء عملية التفكك. ومع ذلك ، إذا كان بعد 48 ساعة وتجمعت الخلايا جنبا إلى جنب مع دوالي على عملياتها ، سواء كانت الخلايا غير صحية أو الركيزة بولي - D - يسين غير سامة. كما هو الحال مع معظم ركائز وفعالية بولي - D - يسين تعتمد كثيرا ويجب أن يتم اختبار كل دفعة جديدة. ويمكن الاطلاع على الصور من الثقافات صحية في المراجع 4،11 و 20. يمكن الحفاظ على الخلايا السليمة في مجال الثقافة لمدة تصل إلى أسبوعين 8.
أسلاف الخلايا العصبية تبدأ الحبيبية للتمييز على الطلاء 8،12،13،14. بمجرد إنشاء كثافة الطلاء الأمثل لدراستك ، ينبغي الحفاظ عليه ، لأن تعزيز الانتشار بفعل عوامل مثل إشارات نوتش 15 ، وسوف تتكاثر الخلايا أكثر في الكثافات السكانية المرتفعة. ويمكن لانتشار الأسلاف عصبون الحبيبية مطولة إلى حد كبير عن طريق إضافة القنفذ الصوتي (SHH) إلى 12،13،14 المتوسط. ويمكن أيضا أن تضاف Laminin باعتبارها الركيزة بالإضافة إلى بولي يسين - D لتعزيز neurite ثمرة 16،17. هذه الميزات من الخلية الحبيبية الثقافة نقدم نظاما لدراسة إما بيولوجيا الخلايا العصبية الحبيبية أو تنظيم تمايز الخلايا إلى خلايا عصبية 6،18،19 الأسلاف.
وتتألف مبدئيا من خلايا دماغ الفئران المعزولة بعد الولادة من خليط من الخلايا العصبية والحبيبية الحبيبية أسلاف الخلايا العصبية في مراحل مختلفة من دورة الخلية 8. هناك أيضا وinterneurons دبق نجمي الخلايا موجودة في تحقيقه هو العزل / الثقافة وتنقية مزيد من الخلايا العصبية والأسلاف الحبيبية الحبيبية (95 ٪ -99 ٪) من الفصل المتدرج Percoll 4. وقد استخدمت الخلايا الحبيبية المخصب الحصول عليها دون استخدام العازل Percoll خطوة متدرجة لدراسة تنظيم انتشار الأسلحة النووية وتمايز الخلايا العصبية الأسلاف الحبيبية ، 18،19،20. في التثبت من ذلك ، نجد أن الخلايا في عزل السكان عن طريق تجاوز الفصل المتدرج Percoll سترد بقوة على الخطوة التي SHH المتبقية في دورة الخلية لعدة أيام ، وأنه بدون إضافة SHH ، هناك القليل جدا من الانتشار في الثقافات كما هو مبين بواسطة تلطيخ مع الخلية صانع الانتشار ، Ki67. ومع ذلك ، إذا الثقافات سوف تستخدم خارج عدة أيام في المختبر ، فمن المستحسن أن تدرج خطوة متدرجة Percoll لتقليل التلوث من الخلايا العصبية التي تنتشر الحبيبية غير العصبية الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر باربرا Carletti وآنا ماري كيني للحصول على اقتراحات لا تقدر بثمن. معتمد من قبل HYL "الهرمونات : الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية" التدريب غرانت ، DK07328. بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة 5R01 NS16951 منحة (CAM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | |
| Spinal Needle | BD Biosciences | 405182 | 20G x 3-1/2 inches |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma-Aldrich | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK 003150 | Kit is good for five isolations. |
| Permaset scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| 4-well culture dish | Nalge Nunc international | 176740 | |
| 6-well culture dish | Nalge Nunc international | 140685 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton. (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Mass. 419-419 (1998).
- Hatten, M. E. The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).
- Carletti, B., Rossi, F. Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).
- Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).
- Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).
- Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).
- Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. Cerebellar Cortex: Cytology and Organization. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1974).
- Messer, A. Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).
- Ruiz I Altaba, A. Development. 126, 3205-3205 (1999).
- Wallace, V. A. Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).
- Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).
- Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).
- Kenney, A. M., Rowitch, D. H. Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).
- Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. Development. 130 (1), 15-15 (2003).
- Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. Development. 128, 1481-1481 (2001).
