Transferencia celular adoptiva: Introducción de cenocitos de un ratón donante a un ratón huésped y evaluación del éxito a través de FACS

1. Preparación

1. Antes de comenzar, ponte guantes de laboratorio y la ropa protectora adecuada.
2. Esterilice todas las herramientas de disección, primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego seque bien.
3. Preparar 50 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 2% de suero de becerro fetal (FCS).

2. Disección

1. Usando un sistema de administración de dióxido de carbono, eutanasia el ratón por hipoxia. Asegure el ratón eutanasiado en una placa de disección en posición supina y realice una laparotomía longitudinal utilizando tijeras y fórceps.
2. El uso de fórceps mueve los intestinos y el estómago en el lado derecho del abdomen para exponer el estómago y el bazo. El bazo está unido al estómago.
3. Usando fórceps separa cuidadosamente el bazo del estómago y colócalo en la placa Petri que contiene 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Aislamiento celular inmune

1. Coloque el bazo sobre un colador de células de 40 m sobre la placa Petri. Aplastar el bazo con un émbolo para disociarlo.
2. Recupere las células adheridas encerrando el émbolo y el colador con 1 ml de HBSS 2% FCS.
3. Transfiera el bazo disociado y el líquido a un tubo centrífugo de 15 ml.
4. Lavar la placa Petri con 5 mililitros de HBSS 2% FCS y transferir el fluido al tubo de 15 ml.
5. Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
6. Resuspenda el pellet en 2 ml de pipeta de cloruro de amonio de potasio hacia arriba y hacia abajo para resuspender el pellet y lejar los eritrocitos.
7. Espere 2 min y agregue HBSS 2% FCS al pellet resuspendido para obtener el volumen de hasta 14 ml.
8. Centrifugar el tubo de nuevo a 370 x g durante 7 min a 10oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de HBSS 2% FCS pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
9. Cuente las células usando el ensayo de tinción azul trypan y ajuste la concentración celular final a 10⁷ celdas/ml usando el volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

4. Transferencia adoptiva

1. Transferencia de 2 ml de suspensión celular obtenida en un tubo de recogida de 5 ml.
2. Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y luego desechar el sobrenadante.
3. Resuspenda el pellet en 2 ml de PBS y centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC.
4. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 ml de PBS.
5. El uso de una jeringa de 0,5 ml con una aguja de 29 G inyectar 200 l de suspensión celular en el ratón experimental por vía intravenosa en el seno de la sangre retroorbital.
6. Como control, inyectar un segundo ratón en el mismo seno de la sangre con 200 ml de solución salina tamponada de fosfato.

5. Cosecha y tinción de células

1. Cuatro días después de la transferencia adoptiva, eutanasia a los ratones y extirpa el bazo.
2. Cosecha los esplenocitos como se describe en la sección 3.
3. Transfiera 100 l de suspensiones celulares de cada ratón a dos tubos FACS, etiquetados como "control" y "transferidos".
4. Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y luego desechar los sobrenadores.
5. Preparar una mezcla que contenga los cuatro anticuerpos en las diluciones enumeradas en la Tabla 1.

Anticuerpos	Fluorocromo	Dilución
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

Tabla 1: Los anticuerpos mezclan composición. Preparación de cuatro cocteles de anticuerpos utilizando conjugados concentrados de anticuerpos fluorescentes y HBSS.

6. Añadir 100 l de la mezcla a cada tubo, y luego incubar durante 20 minutos en hielo en la oscuridad.
7. Añadir 1 ml de HBSS 2%FCS y luego centrifugar los tubos a 370 x g durante 3 min a 10oC.
8. Deseche los sobrenadores y resuspenda los pellets en 200 l de HBSS 2% FCS.
9. Transfiera las celdas resuspendidas a nuevos tubos FACS etiquetados.
10. Utilizando citometría de flujo, como se muestra en el protocolo FACS, evalúe la presencia de linfocitos positivos CD45.2.

6. Análisis de datos

1. Abra el software "FlowJo" y arrastre los archivos para cada tubo en la ventana"Todos los muestras".
2. Haga doble clic en el archivo "transferido"para mostrar las celdas registradas a partir de esa muestra en una gráfica de puntos que muestra la dispersión hacia adelante "SSC-A" en el eje Y y la dispersión lateral "FSC-A" en el eje X.
3. Haga clic en "polígono" y cree una estrategia de gating para seleccionar linfocitos, luego distinga las células de donante y host usando marcadores de superficie celular (CD45.1, CD45.2), y luego caracterice CD45.2⁺ población celular (CD3, CD4).
4. Repita los pasos del análisis con el archivo "control mouse".
5. Para visualizar la población de celdas, haga clic en"Editor de diseño".
6. Arrastre los archivos "celdas transferidas"y "celdas CD4 transferidas" de "transferidos" y "control" en la pestaña " Editor dediseño".
7. Aparecerá una gráfica de puntos que representa CD45.2⁺ células y linfocitos CD4.
8. Las celdas transferidas CD45.2 solo deben aparecer en la gráfica de puntos "ratón transferido".