Name: 골수에 조혈 세포의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 배우세요 조혈 세포가 골수로 귀환하는 현상을 연구하는 방법을. 특정 세포 집단을 분리하고 염색하여 수혜 동물에 주입한 후, 시간이 지난 뒤 염색 양성 세포 비율을 측정하여 유전적으로 다른 동물 간 귀환 효율을 비교합니다.

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이 프로토콜은 테스트 데이빗 스캐든의 연구실에 최적화되었습니다. 기금은 다나 파버 암 연구소 / 매사 추세츠 종합 병원 임상 혈액 및 종양학 원정대 프로그램에 의해 제공됩니다.

<ol><li> 우리는 실험에 사용되는 세포를 추출하여 유도 실험을 시작합니다. 받는 동물의 긴 뼈와의 틈새로 전체 골수의 위치 추적 이러한 C57BL/6J (WT)로 WT 동물에서 추출한 골수 세포에 대해 서로 다른 있으며, 유전자 변형되는 이러한 경우이 현재 실험을 위해 우리는 밖으로 찾는 데 관심이있다 Lysophosphatidic 수용체 1 (LPAR1) (KO)에 knockouts. </li><li> 우리가 실험을 시작하기 전에, 우리는 우리가이 실험에 필요한 자료를 수집합니다. 세포 대신 전 생체내 분석에 사용되는받는 동물에 이식 될 특히 우리가 실험실에서 모든 마우스 해부는 층류 조직 문화 후드에서 수행됩니다. 우리는 후드 안쪽에 파란색 시트를 삽입하여 시작합니다. 필요한 다른 개체는 포셉 한 켤레와 autoclaved되었습니다 가위 날카로운 쌍, 살균 일회용 메스와 알코올 면봉을 포함합니다. 우리는 수정 PBS 및 살균 6 자 번호판, 절구가 필요합니다, 유봉, 50cc 청색 원뿔 관과 70uM 일회용 필터를 얹은. </li><li> 우리가 하나 WT 한 KO 마우스를 복용하여 시작합니다. </li><li> 이 생쥐는 CO 2 흡입에 의해 euthanized 후 5 초 동안 isopropranolol 70%에 담근 수 있습니다. 이 단계는 마우스 모피와 우리 손에 관심 세포의 오염이 셀이나 실험 결과의 수율에 타협을 주도하지 않은 것을 방지할 수 있습니다. </li><li> 생쥐는 다음 포셉와 날카로운 가위를 사용하여 차례로 해부하고 있습니다. 우리는 일반적으로 일상의 문제로 WT 마우스로 시작합니다. 작은 싹둑는 복부와 피부가 다음 손을 사용 늘어입니다 overlying 마우스의 복부 피부에 이루어집니다. 피부는 쉽게 뒷다리 사지에서 온다. 대퇴골과 경골은 다음이가 골수의 대량 포함되어 대퇴골의 머리를 이동시키다하지 돌보는 압축이 풀립니다. 위쪽 팔다리는 몸통이 고정되어 유지하면서 단순히 그들에게 견인을 적용하여 동물의 몸통에서 분리됩니다. 이것은 한 조각으로 상부 사지를 제거합니다. humeri 그런 다음 상단 사지에서 추출됩니다. </li><li> 삭제 뼈가 여섯 잘 접시에 추가되었습니다 수정하는 PBS에 배치됩니다. 수정 PBS는 열 inactivated 태아 소 혈청과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5 M pH8 2 CC 2 ML를 추가하여 이루어집니다. 이 솔루션은 다음 Nalgene 0.45 음 .. 필터를 통해 여과되고 최소한 한 달 동안 섭씨 4 도에 저장할 수 있습니다. </li><li> 그것은 정확하게 WT와 KO 뼈를 식별하기 위하여 접시에있는 우물에 레이블을하는 것이 필수적입니다. </li><li> 마우스 주검이 제거되고 해제 처리됩니다. </li><li> 새로운 시트는 후드에 배치되고 뼈는 일회용 메스를 사용하여 청소합니다. </li><li> 청소 뼈가 절구에 한 번에 하나의 마우스를 위치하고 있습니다. 수정 PBS의 두 ML은 절구에 추가되고 뼈는 유봉을 사용하여 조각하고 있습니다. 그것은 10과 함께 다음과 유봉의 서있는 움직임과 뼈가 원형 회전 움직임으로 그들을 격파 첫번째 조각하는 것이 중요합니다. 난 보통 시계 방향으로 50, 50 다음 시계 반대 방향으로 운동을하고 그래서 절구에 남아있는 자료는 색상과 수정된 PBS에 흰색 때까지​​ 계속 흰색 또는 투명 남아있는 자료에 추가됩니다. </li><li> 50 원형 파쇄 움직임의 모든 설정하면, 우리는 박격포에서 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 위치 70 음 필터 액체를 전송합니다. 필터마다 전송 후 박격포에 PBS 2 ML을 추가하는 것을 잊지 마십시오. 당신은이 세포의 apoptosis에 이끌로 시도하고 격파 마른 뼈를 또는 시간의 기간 동안 그들이 건조두고 싶지 않아. </li><li> 절구에 자료가 흰색이됩니다되면, 필터의 재질은 박격포로 전송되고 분쇄 다시 수행됩니다. 이것은 필터에있는 세포가 낭비되지 않도록 보장합니다. 보통 그것은 다시 세포의 추출이 완료되는 시점 색상의 박격포 흰색의 소재를 만들기 위해 원형 회전 운동 중 하나 또는 두 세트 걸립니다. </li><li> 원뿔 튜브의 솔루션은 이제 (주십시오 WT와 KO 마우스 별도의 세포를 유지하는 기억 해요. 따라서 당신이 10 1,200 rpm으로 두 개의 다른 튜브 (KO 세포와 WT 세포와 함께 한 다른). 원심 분리기를해야합니다 centrifuged입니다 분. </li><li> 각각의 튜브에 대해 별도의 흡인기의 pipettes를 사용하여 표면에 뜨는를 대기음. 각각의 펠렛에 ACK 용해 버퍼 2 참조를 추가합니다. 이 용해 버퍼 멸균해야합니다. 5 분 얼음에 품어. </li><li> 각각의 튜브에 수정된 PBS 8 CC를 추가합니다. 96 잘 접시에 두 개의 별도 우물로 10 각 튜브의 UL과 피펫을 가져가라. 원심 분리기에 튜브를 삽입하고 10 분 동안 1,200 rpm으로 그들을 스핀. </li><li> 튜브가 회전하는 동안 관심의 세포를 지니고 있던 96 잘 접시의 각각 잘하는 tryphan 청색 색소의 30 UL 및 수정된 PBS 60 UL를 추가합니다. </li><li> hemocytometer이 혼합 10 UL (최대 아래로 pipetting으로 잘 섞어주세요) 추가하고 네 가지 바깥 광장에있는 세포를 계산합니다. </li><li> ML 당 각 샘플의 셀 개수는 4 multiplie로 나눈 따라서 계산 세포의 숫자입니다100 000에 의해 D. </li><li> 원심 분리가 완료되면, 원심에서 튜브를 제거하고 ML 당 20,000,000 세포의 농도에서 칼슘, 마그네슘 또는 L의 글루타민없이 PBS에 세포를 resuspend. 당신은 가능성 KO 동물에 대한 WT 볼륨 5 ML에 대한 볼륨 약 5 ML을 것입니다. 이 단계 이후에 우리는 프로토콜 PBS를 수정하지 PBS를 사용합니다. </li><li> 각각의 튜브를 추가하려면 DiI, 세포 얼룩의 염료는 5uM의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. 10 초 즉시 와동. 10 분 37도에서 부화하고 불빛에 노출하지 마십시오. </li><li> 1,200 rpm으로 10 분간 PBS와 스핀으로 튜브를 입력합니다. </li><li> 원심 분리 후, 뜨는을 기음과 ML 당 40,000,000 세포에 PBS에 세포를 resuspend. </li><li> 27G 바늘 (WT 마우스 및 KO 마우스 5 주사기 5 주사기) 1 CC의 주사기로 500 UL을로드합니다. 그것은 각 코호트 6 주사기를 준비하는 신중한 수 있습니다. 우리가 다음에 할 건데 꼬리 정맥 주사가 힘들 수 있으므로 여분의 하나가 도울 수 있습니까. </li><li> 험악에서 DiI을 유지하기 위해 호일로 주사기를 커버. </li><li> 각받는 동물로 세포 혼합물 500 UL을 주사, (각 코호트 5). </li><li> 이 동물은 4-24시간 전에 분사에 방사선 조사의 9 쥐와 함께 조사해야합니다. </li><li> 주사 후 48 시간, 각받는 동물의 뒷다리 사지에서 수확 골수. </li><li> 기증자에 대한 위에 설명된대로 처리합니다. PBS 1 CC의 각 동물의 세포를 Resuspend. hemacytometer를 사용하여 셀 개수를 구합니다. </li><li> BD에서 LSR II 흐름 cytometer 또는 이에 상응하는 악기를 읽어 보시기 바랍니다. 결과는 DiI 긍정하는 분석 골수의 비율이나 세포의 절대 숫자로 표현할 수있다. </li></ol>

<ol><li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li>
</ol>

호밍는 과정입니다 의하여 줄기 세포, 전구 세포와 차별화된 세포, 혈액 스트림 또는 마우스의 골수 캐비티에 주입 후 골수에 그들의 방법을 포함하여 골수 세포. 정의에서 분명로서, 과학자가 조혈 줄기 세포, 전구 세포 또는 immunophenotyping으로 식별 및 세포 분류에 의해 격리 차별화된 세포의 위치 추적을 공부하기로 수도 있습니다. 일반적으로 과학자들은 혈통 마커에 대한 고갈 골수 세포를 주입하고 따라서 시조와 줄기 세포에 대한 풍부. 관심 주입의 세포의 선량이 실험의 변수입니다. 세포의 수는 500 000에서받는 마우스마다받는 마우스 당 20 만 다를 수 있습니다. 더 많은 세포가 하나는 골수에서 쉽게 검색을 주입하실 수 있습니다. 휴대폰 번호 가용성은 주입 수를 제한할 수 있습니다. 20000000 LKS 슬램 세포를 정렬하면 하나 이상의 지정된 범위의 하단으로 세포의 숫자를 사용하기로 결정 수있는 경우에 대부분의 실험실 설정에서 현재의 기술과 심지어 허무 아마...

<table><tbody><tr><td>DPBS (Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>멸균 소태아혈청 (Sterile Fetal Bovine Serum)</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>BS3033</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA (pH 8.0)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-150</td><td></td></tr><tr><td>Tryphan Blue 용액</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼 (ACK Lysing Buffer)</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Isopropranolol U.S.P.</td><td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD 세포 라벨링 용액</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI 세포 라벨링 용액</td><td>Invitrogen</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

골수에 조혈 세포의 유도

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

호밍는 이식 조혈 세포와 합치다 여행이나 골수에 거주를 설정하실 수 있습니다 약자 현상입니다. 다양한 chemomkines과 수용체는 조혈 줄기 세포의 유도에 관여하고 있습니다. [1, 2] 본 논문은 조혈 줄기 세포 연구에 사용되는 고전적인 추적 프로토콜을 설명합니다. 일반적으로 이것은 누구의 추적 조사 요구되는 세포 인구를 분리 관심 염색이 인구가 얼룩과받는 동물의 혈류에 이들 세포를 주입이 포함됩니다. 받는 동물은 다음 주입 및 비율이나 관심의 염색에 대한 양성 세포의 절대적인 번호에 대한 평가 골수 후 미리 정해진 시간에 희생됩니다. 가장 일반적인 실험 계획, 두 유전자 별개의 동물로부터 조혈 세포 (야생 동물 유형 및 해당 노크 아웃)의 위치 추적 효율 중 하나에 비교됩니다. 이 문서는 실험과 같은 내용의 프레임 워크에있는 조혈 세포 유도 프로토콜을 설명합니다.

이 문서는 골수에서 틈새에 조혈 세포의 추적을 연구하는 데 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

호밍(Homing)은 이식된 조혈 세포가 골수로 이동하여 생착하거나 정착하는 현상을 말합니다. 다양한...

호밍(Homing)은 이식된 조혈 세포가 수신자의 골수로 이동하여 정착하는 현상입니다. 본 논문은 조혈 세포가 골수의 상대적 영역으로 호밍하는 과정을 연구하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 관심 세포군을 분리하고, 염료로 해당 세포군을 염색한 뒤, 이를 수신 동물의 혈류로 주입하여 연구를 진행합니다.그 후 일정 시간이 지나면 동물 내에서 염색제에 양성 반응을 보이는 세포의 백분율을 측정합니다. 이 방법을 통해 유전적으로 서로 다른 두 동물로부터 유래한 이 세포들의 호밍 효율을 비교할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Massachusetts General Hospital의 재생의학 센터와 Harvard Stem Cell Institute에 있는 Dr. David Skadden 연구실의 박사후 연구원 RHI Reen Yusef입니다.오늘은 조혈모세포가 정상적으로 서식하는 곳인 골수로 이동하는 호밍(homing) 현상을 연구하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 다양한 유전자 변형 마우스 유래 조혈모세포의 호밍 차이를 연구하기 위해 이 프로토콜을 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.호밍 실험을 시작하기 위해, WT와 리소포스파티드산 수용체 1(LPA R 1) 결핍 동물의 골수를 모두 추출합니다. 모든 마우스 해부는 라미나 플로우 조직 배양 후드 내에서 수행해야 하며, 특히 세포를 수용 동물에 이식할 경우 더욱 주의해야 합니다. 해부를 위해 먼저 후드 바닥에 라이너를 깝니다. 그다음 오토클레이브 처리된 핀셋과 날카로운 가위, 멸균 일회용 메스, 알코올 스왑을 포함한 해부 도구들을 라이너 위에 배치합니다.다음으로 후드 안에 변형된 PBSA 병, 멸균된 6-웰 플레이트, 막자사발과 막자, 50 cc 파란색 캡 원심분리관 및 일회용 필터를 배치합니다. CO2를 이용한 안락사 후, 관심 세포의 오염을 방지하기 위해 마우스의 몸을 70% isopropanol로 5초 동안 멸균합니다. 마우스 털의 경우, 이 단계가 세포 수득률이나 실험 결과에 영향을 주지 않는 것으로 보입니다.마우스를 멸균한 후, 포셉과 날카로운 가위를 사용하여 마우스 복부의 복측 피부를 살짝 절개합니다. 다음으로, 손을 사용하여 피부를 당겨 벗겨냅니다. 이때 피부는 뒷다리까지 벗겨져야 합니다.대퇴골두가 빠지지 않도록 주의하며 대퇴골과 경골을 조심스럽게 추출합니다. 여기에는 다량의 골수가 포함되어 있기 때문입니다. 다음으로, 몸통을 고정한 상태에서 상지를 가

homing-of-hematopoietic-cells-to-the-bone-marrow

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

골수의 조직학적 데이터를 정량적으로 분석하는 전략을 제시합니다. 조직 절편에서 형광 표지된 세포에 대한 컨포칼 현미경 검사는 자동으로 분석되는 2차원 이미지를 생성합니다. 다양한 세포 유형의 공동 국소화 분석을 시뮬레이션된 이미지의 데이터와 비교하여 세포 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공합니다.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

생쥐에서 다른 인간화 된 골수 틈새를 만들고 살아있는 방법이 제시됩니다. human mesenchymal cells에 의해 만들어지는지지 적 틈새를 기반으로, 인간 내피 세포의 첨가는 인간 혈관의 형성을 유도하는 반면, rhBMP-2의 첨가는 인간 - 마우스 키메라 성숙한 뼈 조직의 형성을 유도한다.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

여기에서는 인간 골수의 생체 내 구조의 복잡성을 반영하는 구현하기 쉽고 표준화된 미세생리학적 시스템을 설명하여 광범위한 정상 및 병리학적 사건을 미세하게 연구할 수 있는 관련 모델을 제공합니다.

생리학적 또는 종양적 맥락에서 상주 세포 간의 역학 및 상호 작용을 조사하기 위한 인간 골수 3D 모델

우리는 개발하는 동안 중요한 조혈 기관으로 태반을 확인했습니다. 우리는 조혈 줄기 세포 (HSCs)이 생성되는 독특한 microenvironmental 틈새의 태반에서 확장 둘 발견했습니다. 여기, 우리는 마우스 태반에 HSCs의 격리 및 시각화에 필요한 실험 기법을 설명합니다.

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

배우세요 조혈 세포가 골수로 귀환하는 현상을 연구하는 방법을. 특정 세포 집단을 분리하고 염색하여 수혜 동물에 주입한 후, 시간이 지난 뒤 염색 양성 세포 비율을 측정하여 유전적으로 다른 동물 간 귀환 효율을 비교합니다.

골수에 조혈 세포의 유도

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