Name: 비 - 방사성 현장에서 하이브 리다이 제이션 노르웨이 스프루스에 대한 해당 프로토콜과 식물 종의 범위 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 배우세요 비방사성 현장에서 하이브리다이제이션 프로토콜을 이용하여 노르웨이 스프루스 및 다양한 식물 종에서 유전자 발현을 분석하는 방법을 익히세요. 이 기법은 식물 조직에서 효율적이고 재현 가능한 결과를 제공합니다.

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우리는 스피커 음성으로 자원 봉사를위한 영화 음악을 제공 앤더스 보빈과 마이클 엘리엇 주식 매우 감사하고 있습니다. 지원 칼 Trygger 재단, 농업 과학, 스웨덴 연구 협의회 (VR)의 스웨덴의 대학에서 전략적 연구 프로그램 농업 기능성 유전체학 (AgriFunGen), 그리고 환경에 대한 스웨덴 연구 협의회, 농업 과학, 그리고 공간 계획 (FORMAS에 의해 제공된 ).

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<li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li>
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<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li>
<li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li>
<li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li>
<li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li>
</ol>

P. 두 측면 아비 에스 프로토콜 A.에 비해 최적화되었습니다 thaliana / B. napus 프로토콜 RNase 처리 및 proteinase K의 농도. RNase 배경 신호를 제거하기 때문에 신호 특이성의 17 증가합니다. proteinase K 처리는 프로브 입력과 관심의 RNA 수영장에 잡종 수 있도록 조직을 permeabilize 필요합니다. DAL13 안티 센스 탐사선은 30 분 (그림 2D, F 및 H)의 RNase 취급 섹션에 비해 RNase - 치료 (그림 3C, E, G)없이 높은 신호를 주었다. RNase - 치료 신호를 강화하지 않았으므로 그것은 프로토콜에서 제거되었습니다. 1, 3 및 5 μg / ML, proteinase K 치료는 세 가지 다른 농도에서 테스트되었습니다. P.의 경우에는 낮은 또는 아니오 신호 아비 에스는 1 μg / ML proteinase K (그림 3C - D)를 사용하여 관찰되었다. 5 μg / ML proteinase K를 사용하면 강한 신호가 3 μg / ML (그림 3E - F), 5 μg / ML 모두 얻은 것입니다 (그림 3G - H) proteinase K.는 신호의 강도에 뚜렷한 차이가 있기 때문에 발견 3 μg / ML에 비해, 우리는 프로토콜 3 μg / ML을 사용하기로 결정했습니다. 그것은 가능성이 그 P.의 높은 proteinase K의 농도의 필요성 아비 에스 남성 원뿔은 A. 비교 thaliana와 B. napus 꽃 꽃봉오리는 phenolics와 다당류의 높은 수준과 더 컴팩트한 조직에 의한 것입니다. 고정 동안과 A. 사이의 차이를 삽입 thaliana / B. napus 프로토콜과 P. 아비 에스 프로토콜은 분명합니다. 관심의 조직은 RNA 보존을 제공하는 고정하고 제대로 고정 재료는 mRNA가 매우 풍부에도 불구하고 낮은 또는 탐지 신호를 줄 수 있으므로 이것은 중요한 단계입니다. 조직 취소 및 조직 손상을 방지하기 위해 점진적 변화의 왁스에 포함된, 건조하고, 어떤 프로토콜을 0.85 % NaCl에서 추가 전지 3 수축과 팽창을 피하기 위해 탈수의 에탄올에 추가됩니다. 퍼가기 동안 탈수 단계는 최소한 RNase 활동을 유지하기 위해 얼음을 수행할 수 있습니다. P. 년 아비 에스 프로토콜 4 % paraformaldehyde의 해결책 일부는 아마도 아무런 차이 3도하지 않습니다 주장되는 경우에도 더 나은 RNA 보존 17를 제공하도록되어 0.25 %의 글루 타 알데히드를 포함하고 있습니다. 자료를 sectioning 후 하이브리드화 이전 (비 특정 프로브의 결합 그리고 마침내 탈진을 줄이기 위해 치료 permeabilized rehydrated 즉 dewaxed,,,) 슬라이드에 고정하고 pretreated입니다. 여기에 제시된 프로토콜 전체 검색 절차가 일반적인 실험실에서 수행할 수, 신호 1-3 일 이내 개발 및 배경을 통해 신호 간의 비율을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 디그 - 라벨이 프로브는 일반적으로 방사능 표시 프로브에 비해,보다 뚜렷한 신호를보다 안정되고 연속 실험에 활용할 수 있습니다. 반면에, 감도는 방사성 프로브 17에 비해 줄일 수있다. 원위치 하이브리드화에서는 특정 mRNA의 특정 라벨 프로브를 사용하여 표현을 감지합니다. 라디오 레이블은 강력하고 민감한 분류 방법입니다하지만 방사능의 처리가 필요하며 그 결과가 감지되기​​ 전에는 몇 주 정도 소요됩니다. 한편 항원 - 라벨 프로브는 덜 위험한,보다 안정되고 겨우 17 몇 일 동안 검색 매체 노출을 필요로합니다. 따라서 항원 라벨링 방법은 현재 지배하고 있습니다. 에 관계없이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 프로브 디자인입니다. 케어는 탐사선이 높은 특이성을 가지고 있으며, 양질의 UTPs로 분류되어 있는지 확인하십시오로 이동해야합니다. 가끔 하이브리드화 온도 및 / 또는 반응 길이는 특정 프로브에 따라 조정해야합니다. 디그 - 라벨 프로브에 따라 우리 수정된 프로토콜 A. 이르기까지 종 동시에 mRNA의 표현의 지방화를 촉진합니다 P.로 thaliana 아비 에스, 그리고 약간의 조정 다른 식물 종을에서 사용할 수 있어야합니다. 프로토콜은 남성 콘 옆에도 식물 쏘고의 다른 단계와 P.부터 접합자의와 체세포 배아 모두에서 테스트되었습니다 좋은 결과 (.; Karlgren 외 미발표 결과)와 아비 에스.

<table><tbody><tr><td>무수초산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6404-200ml</td><td>최소 98%</td></tr><tr><td>아크릴아마이드, 선형</td><td>Ambion</td><td>9520</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DIG 항체</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>블로킹 시약</td><td>Roche Group</td><td>11 175 041 910 또는 11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>우혈청알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50g</td><td>최소 98%</td></tr><tr><td>탈이온 포름아마이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denhardts 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532-5ml</td><td></td></tr><tr><td>DEPC, 디에틸피로카보네이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 황산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td><td>Roche Group</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 (25%)</td><td>Histolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>Ambion</td><td>9510G</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear II</td><td>Histolab</td><td></td><td>조직 매립 시 Tissue-clear, Histoclear II, 자일렌 또는 이와 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Histowax</td><td>Histolab</td><td></td><td>매립을 위해 Histowax 또는 Paraplast를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1kg</td><td>매립을 위해 Histowax 또는 Paraplast를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Phusion&amp;#8482; High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Finnzymes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe-on Plus 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5mg</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-clear</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td>조직 매립 시 Tissue-clear, Histoclear II, 자일렌 또는 이와 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>트리에탄올아민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1377-100ml</td><td>최소 98%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>실험실 표준 제품 사용</td><td></td><td>Triton X-100 및 Tween-20 중 하나 또는 둘 다를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83853-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>실험실 표준 제품 사용</td><td></td><td>Triton X-100 및 Tween-20 중 하나 또는 둘 다를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Western Blue</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비 - 방사성 현장에서 하이브 리다이 제이션 노르웨이 스프루스에 대한 해당 프로토콜과 식물 종의 범위

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

높은 처리량 표현 분석 기술을 사용할 수 있기 때문에 오늘날 각각의 조직을 해부에 문제가 제한됩니다 과학자에게 표현 프로필 오버플로하지만, 구체적인 조직 표현의 측면에서 그들의 해상도를 제공합니다. 표현 데이터 확인 및 세포 특정 mRNA 표현을 집중하기 위해 현장 하이브리드화, 사용 기술의 예를 사용하여 표현식 패턴을 구비해야합니다. 현장 하이브 리다이 제이션 방식으로이 힘드는, 시간이 많이 걸리는이며 종종 종과 조직에 따라 광범위한 최적화가 필요합니다. 원위치 실험에서 같은 침엽수 노르웨이 스프루스 (피세아 아비 에스)로 우디 수종으로 수행하기 위해 상대적으로 더 어렵습니다. 여기 P. 포함한 식물 종의 다양한에서 빠르게 적용 현장 하이브리드화 프로토콜에서 수정된 파고를 제시 아비 에스. 변경된 RNase 처리 및 proteinase K 농도를 포함한 몇 가지 조정을 통해, 우리는 동종 한 gymnosperm의 남성 생식 기관의 유전자 두 angiosperm 종의 조직 구체적인 표현을 연구하기 위해 프로토콜을 사용할 수 있습니다; P. 아비 에스, Arabidopsis thaliana와 Brassica napus. 프로토콜은 공부 종 및 유전자 동일하게하였습니다. AtAP3과 BnAP3가 A에서 두 번째 및 세 번째 윤생체 플로랄 장기에서 관찰되었다 thaliana와 B. P.에서 남성 원뿔의 microsporophylls에 napus와 DAL13 아비 에스. P. 들어 아비 에스의 조직을 permeablize하는 데 사용되는 proteinase K의 농도는, 3 증가야만 G / ML 대신 1 개 소형 조직 및 phenolics와 다당류의 높은 수준을 가능으로 인해 G / ML. 모든 종족에 대한 RNase 처리는 특이성에 해당 증가없이 감소 신호 강도로 인해 제거되었습니다. 꽃 식물과 구과를 맺는 나무 모두의 상동 유전자의 조직 구체적인 표현 패턴을 비교하여 우리가 현장 프로토콜의 파고는 분 조정, 여기를 제시 것을 보여주는 식물 종의 다양한 적용할 수 있습니다. 따라서 프로토콜은 광범위한 종 특정 최적화 및 발굴 분류 프로브에 찬성 radioactively 레이블 프로브의 힘드는 사용 모두를 방지합니다. 우리는 영화에있는 프로토콜의 기술적 요구하는 단계를 설명하기 위해 선택했습니다. 안나 Karlgren 제니 칼슨은이 연구에 동등하게 공헌했습니다. 해당 저자 : Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se에서 Anna.Karlgren @ ebc.uu.se와 젠스 F.의 Sundström에 안나 Karlgren

우리는 수정된 발굴을 설명<em&gt; 현장에서</em신속하고 노르웨이 스프루스를 포함한 식물 종의 광범위한 적용됩니다&gt; 하이브리드화 프로토콜. 변경된 RNase 처리 및 proteinase K 농도를 포함한 몇 가지 조정을 통해 프로토콜은 서로 다른 조직과 종의 연구에 사용할 수 있습니다.

오늘날 이용 가능한 고처리량 발현 분석 기술은 과학자들에게 방대한 양의 발현 프로파일을 제공하지만, ... 측면에서의 해상도는

유럽가문비나무 및 다양한 식물 종에 적용 가능한 비방사성 제자리 하이브리드 형성(in situ hybridization) 프로토콜입니다. Carre Etal. 안녕하세요, 제 이름은 AM GaN이며, 스웨덴의 OBS 대학교와 스웨덴 농업과학대학교에서 연구하고 있습니다.우리는 여러 가지 식물 종에 적용 가능한 곤충 방문 프로토콜을 수립하였습니다. 오늘은 그중 까다로운 몇 가지 단계들을 보여드리겠습니다. 본 프로토콜에서는 포매, 절편 제작 및 실제 곤충 방문 실험의 다양한 단계들을 설명하겠습니다.실험실 1의 고정 및 포매 단계로 이동하여 프로토콜의 9단계부터 11단계까지 진행하겠습니다. 9단계, 페트리 접시와 몰드를 60°C로 예열합니다. 10단계, 핀셋을 가열하고 조직을 접시에 고르게 분배합니다.조직이 완전히 덮이도록 histo wax를 더 추가합니다. 11단계에서는 실온에서 왁스를 굳힙니다. 프로토콜의 12단계부터 19단계까지 두 번 반복합니다.핫플레이트를 켜고 녹인 조직용 왁스를 준비합니다. 저온실에서 샘플을 꺼냅니다. 13단계에서는 메스를 사용하여 조직 왁스 블록을 조심스럽게 절단합니다.절단이 용이하도록 조각의 모양을 잡습니다. 14단계에서, 블록의 앞부분과 뒷부분을 가열하여 서로 융합시킵니다. 준비된 시료를 4°C에서 경화시킵니다.15단계에서는 왁스 블록을 6~8 µm 두께의 섹션으로 절단합니다. 마이크로톰을 사용하여 섹션들을 하나의 긴 리본 형태로 연결합니다. 리본을 절단하여 종이 위로 옮깁니다.이 시점에서 실체 현미경으로 개별 섹션을 검사하여 관심 있는 섹션을 선택할 수 있습니다. 조직이 있거나 에오신으로 염색된 경우 검사가 더 수월합니다. 17단계에서는 슬라이드에 RNA-free Milli Q water를 첨가합니다.리본을 작은 조각으로 잘라 슬라이드 위에 올립니다. 슬라이드를 핫플레이트로 옮깁니다. 17단계에서는 리본이 42 °C 플레이트 위에서 1~2분 동안 평평하게 펴지도록 둡니다.Kim wipe를 사용하여 물기를 제거합니다. 19단계, 조직이 슬라이드에 부착되도록 슬라이드를 42 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. in situ 하이브리드화 4.1 in-situ 섹션의 프로토콜 내 전처리 단계 36~48을 참고하십시오.36단계에서는 조직층의 절편들을 분리합니다. 슬라이드를 일정한 간격으로 랙에 배치하여 서로 다른 용기 사이의 이동을 용이하게 한 뒤, 절편들을 탈수합니다. 에탄올 시리즈에서 격렬하게 저어주며 무수초산을 첨가합니다.단계 45, 무수 초산 처리 4.2 인 시투(in situ) 하이브리다이제이션 준비. 프로토콜의 단계 49에서 52까지. 단계 51, ProOne Plus 슬라이드의 숙성.용액의 점도가 높습니다. 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 슬라이드를 습윤 챔버에서 배양하십시오.4.3 초기화. 하이브리드화 후, 프로토콜의 53단계부터 72단계를 수행합니다. 62단계에서는 슬라이드를 버퍼 블록과 함께 플라스틱 용기에 넣어 배양합니다.63단계, 슬라이드가 충분히 덮일 정도로 블로킹 용액을 첨가합니다. 항체는 에이징(aging) 방식을 사용하여 슬라이드에 첨가합니다. 에이징 방식은 Prob Bon Plus 슬라이드에서만 가능합니다. 이와 유사한 설계의 슬라이드의 경우, 65단계에서 모세관력에 의해 anti-dig 항체 용액이 끌어올려지도록 합니다.이 단계를 반복합니다. 이전과 마찬가지로 70단계에서 샌드위치 방식을 사용하여 western blue 용액을 흡입합니다. anti dig 항체 용액과 마찬가지로 western blue 용액을 두 번 흡입하는 점에 유의하십시오.65단계 및 71단계에서 슬라이드를 암소에서 1~5일 동안 배양합니다. 실온에서 실체 현미경을 통해 하이브리다이제이션 신호를 모니터링할 수 있습니다. 슬라이드가 여전히 샌드위치 상태인 동안, 보라색에서 갈색의 염색 부위를 관찰할 수 있어야 합니다.이것은 실제 CW 스테이션 실험의 결과물입니다. 여기서 신호는 보라색 또는 갈색의 염색으로 나타납니다.

non-radioactive-situ-hybridization-protocol-applicable-for-norway

Research

연구

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Biology

생물학

이 프로토콜은 아닌 방사성을...

더블 형광 현장에서</em신선한 두뇌 섹션> 하이브 리다이 제이션

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

이 프로토콜이 성공적으로 양적 척추 종의 여러 조직 유형의 수준과 mRNA의 표현의 공간적 패턴을 감지하는 데 사용됩니다. 방법은 낮은 풍요로움의 성적 증명서를 감지하고 동시에 슬라이드 수백 처리 가능합니다. 우리는 예제와 같은 조류 배아 뇌의 형성의 표현 프로파일을 사용하여이 프로토콜을 제시한다.

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

우리는 곤충과 식물 조직에서 바이러스와 박테리아의 현지화 여기 현장 하이브리드 화에 간단한 형광 (FISH) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 산에서의 mRNA의 시각화 및 미세한 부분에 대한 확장 할 수 있습니다.

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

이 프로토콜은 난치성 식물 조직에 유용한 간단한 Hybrid-Cut 조직 절편 방법을 설명합니다. 양질의 조직 절편은 해부학적 연구 및 현장 교잡(ISH)을 포함한 기타 생물학적 연구를 가능하게 합니다.

하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

주사 전자 현미경 관찰을 위한 생물학적 샘플 처리의 문제에는 세포 붕괴, 습한 미세 환경의 샘플 처리 및 세포 파괴가 포함됩니다. 꽃 분열 분열체, 난균 낭종 및 곰팡이(Agaricales)와 같은 까다로운 샘플을 준비하는 데 적합한 저렴하고 비교적 빠른 프로토콜이 여기에 컴파일되고 자세히 설명되어 있습니다.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.

수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

이 프로토콜은 최적화된 분리, 고정, 표지를 활용하여 분리된 애기장대 핵의 단일 분자 위치 현미경 영상을 효율적으로 수행하여 크로마틴과 RNA 중합효소 II의 신뢰성 있는 나노 규모 시각화를 달성합니다. 이 접근법은 고해상도 영상을 위한 다른 염색질 관련 단백질이나 히스톤 변형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

애기장대 핵에서 단일 분자 위치 현미경을 위한 간소화된 프로토콜

배우세요 비방사성 현장에서 하이브리다이제이션 프로토콜을 이용하여 노르웨이 스프루스 및 다양한 식물 종에서 유전자 발현을 분석하는 방법을 익히세요. 이 기법은 식물 조직에서 효율적이고 재현 가능한 결과를 제공합니다.

비 - 방사성 현장에서 하이브 리다이 제이션 노르웨이 스프루스에 대한 해당 프로토콜과 식물 종의 범위

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