عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

لبدء عزل الحمض النووي الريبي وتحقيق عوائد كافية ، يتم سحب 50 جنينا من أسماك الزرد إلى أنبوب مدمج دقيق من الملاط. يتم استخراج الحمض النووي الريبي أولا باستخدام الثلاث والكاشف والكلوروفورم بعد تجانسها تماما. ثم يتم تنظيف الحمض النووي الريبي وتنقيته باستخدام مجموعة Qiagen RNEZ الصغيرة للحصول على إجمالي الحمض النووي الريبي عالي الجودة غير المتحلل للتطبيقات المستقبلية والتخزين طويل الأجل.

يتم تصنيع الحمض النووي الريبي في منتج CD NA الأكثر استقرارا. يتم تنقية (كدنا) لإزالة خيط قالب الحمض النووي الريبي الأصلي. مرحبا ، اسمي سام بيترسون من مختبر الدكتورة جينيفر فريمان في قسم العلوم الصحية بجامعة بوردو.

سنوضح لك اليوم كيفية استخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة من أجنة الزرد الكاملة وتحويله إلى منتج CDNA. عادة ، نستخدم هذا الإجراء لدراسة ملامح التعبير الجيني. لذلك دعونا نبدأ.

عند العمل مع الحمض النووي الريبي ، من المهم جدا العمل في بيئة خالية من الحمض النووي الريبي. استخدم احتياطات بسيطة مثل حجز أليفة في الأنابيب للاستخدام فقط مع إجراءات الحمض النووي الريبي ورش منطقة العمل بالحمض النووي الريبي بعيدا قبل البدء في استخراج الحمض النووي الريبي الكلي لبدء أعمال الاستخراج في غطاء الدخان وسحب 50 جنينا من أسماك الزرد في أنبوب مقتل دقيق سعة 1.5 ملليلتر. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء وأضف على الفور 250 ميكرولتر من كاشف التريول الذي يحتوي على الفينول.

استخدم مدقة الحبيبات للكذب وتجانس الأجنة لمدة 20 ضربة تقريبا حتى تتعطل الأنسجة بشكل كاف. ثم أضف 750 ميكرولترا من كاشف التريازول واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بالتفكك الكامل لمجمعات البروتين النووي. عندما تنتهي الدقائق الخمس، أضف N 0.2 ملليلتر من الكلوروفورم الممزوج بهز الأنبوب لمدة 15 ثانية واحتضان العينة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ثم جهاز الطرد المركزي عند 12,000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

سوف ينفصل الخليط إلى مرحلة كلوروفورم الفينول الأحمر السفلي ، والطور البيني ، ومرحلة مائية علوية عديمة اللون. الطبقة العليا لا شيء تقريبا 0.6 ملم وتحتوي على الحمض النووي الريبي الذي ينقل الطبقة المائية العلوية بأكملها ، أي شيء تقريبا 0.6 ملم إلى أنبوب FUZE صغير جديد. الحرص على عدم نقل أي من طبقة الطور البيني بجوار ترسيب الحمض النووي الريبي ، أضف 0.5 مل من مزيج الأيزوبروبانول.

ودعونا نجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ثم نطرد العينة عند 12,000 غ لمدة 10 دقائق عند أربع درجات سلزية. يجب أن يشكل الحمض النووي الريبي حبيبات تشبه الهلام. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات واغسلها بإضافة مل واحد من 75٪ من الإيثانول الممزوج بجهاز طرد مركزي مقلوب لطيف عند 7 ، 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الإيثانول وقلب الأنبوب ليجف لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبات بإضافة 100 ميكرولتر من الماء الحر من الحمض النووي الريبي واحتضانه عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. دوامة الإصبع بشكل متكرر للمساعدة في إعادة ترطيب الحمض النووي الريبي.

الآن بعد أن تم استخراج الحمض النووي الريبي من الأجنة ، انتقل إلى تنظيف الحمض النووي الريبي وعلاج Da. لتنظيف الحمض النووي الريبي ، ابدأ بمجموعة Rogen RN الصغيرة السهلة. عند الاستخدام الأول ، أضف أربعة أحجام من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى حجم واحد من RPE العازلة الذي يعمل في غطاء الدخان.

أضف 10 ميكرولترات من بيتا مي كابتو إيثانول لكل مليلتر واحد من RLT العازلة. ثم أضف 350 ميكرولترا من RLT العازلة و 250 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى العينة الممزوجة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات ونقل العينة بأكملها إلى عمود R وسهل يتم تحميله في أنبوب تجميع ملليلتر. جهاز الطرد المركزي عند 8 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق من خلال وأضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW واحد إلى عمود الدوران.

جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 8 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة وتخلص من التدفق لإزالة DA من العينة. اتبع علاج الحمض النووي باستخدام مجموعة الحمض النووي الخالي من الحمض النووي الريبي. عند استلام المجموعة ، أضف 550 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى الحمض النووي واخلطه برفق عن طريق التقليب لتخزين محلول المرق مقسم إلى 10 ميكرولتر ، وحصص وتجميد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

أضف 70 ميكرولترا من RDD المخزن المؤقت إلى 10 ميكرولترات من محلول مخزون واحد للحمض النووي ممزوجا بجهاز طرد مركزي مقلوب لطيف لفترة وجيزة وأضفه مباشرة إلى R وعمود الدوران السهل A. احتضان علاج الحمض النووي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 350 ميكرولترا من المخزن المؤقت RW واحد إلى جهاز الطرد المركزي لعمود الدوران عند 8 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من التدفق من خلال وأضف 500 ميكرولتر من RPE العازل إلى عمود الدوران. احتضان العينة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 8 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من التدفق وأضف 500 ميكرولتر من 75٪ من الإيثانول إلى عمود الدوران. كرر الطرد المركزي عند 8 ، 000 جم ، ولكن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق واترك العمود يجف لمدة خمس دقائق على الفور. جهاز طرد مركزي عند 8 ، 000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي متتبعات متبقية من الإيثانول.

الآن انقل عمود الدوران إلى أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 مليلتر وأضف 10 ميكرولترات من الماء الخالي من النوكلياز لمدة دقيقة واحدة لتصفية جهاز الطرد المركزي للحمض النووي الريبي عند 10،000 جم لمدة دقيقة واحدة. في درجة حرارة الغرفة ، سيكون الحمض النووي الريبي في التدفق من خلال. كرر الشطف مع 10 ميكرولتر أخرى من الماء.

تحقق من كمية ونوعية الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND 1000 باتباع إجراءات تعليمات الشركة المصنعة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتشغيل جل تغيير الطبيعة أو استخدم محلل حيوي Agilent 2100 للتحقق من سلامة الحمض النووي الريبي. إذا كانت جودة الحمض النووي الريبي وكميته مرضية ، فانتقل إلى تخليق CDNA.

أخيرا ، قم بتخزين الحمض النووي الريبي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يمكن إجراء تخليق CD NA. ابدأ تخليق CD NA عن طريق خلط كل مكون من مكونات التمهيدي RNA ودفعه لفترة وجيزة. امزج الحمض النووي الريبي DN NTPs و oligo dt.

أضف كل مكون إلى أنبوب معقم بقوة 0.5 مليلتر صغير إلى ما مجموعه 10 ميكرولترات. للحصول على مجلدات محددة، راجع البروتوكول المكتوب المصاحب. ثم احتضان العينة عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

انقل العينة على الفور إلى ملاط ثلج لمدة 10 دقائق أثناء استدعاء العينة ، وقم بإعداد مزيج رئيسي عازل يصل إلى إجمالي تسعة ميكرولتر كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب. بعد التبريد ، امزج المزيج الرئيسي للمخزن المؤقت مع خليط التمهيدي RNA الممزوج برفق ، واجمعه عن طريق الطرد المركزي القصير. بعد ذلك ، ضع العينة المدمجة لتحتضن في جهاز التدوير الحراري عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

لبدء النسخ العكسي ، أضف ميكرولتر واحدا من الكتابة المرتفعة اثنين RT إلى الأنبوب واخلطه. استمر في الحضانة عند 42 درجة مئوية لمدة ساعة. قم بإنهاء التفاعل عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثم قم بتبريد العينة إلى أربع درجات مئوية وانقلها إلى حمام جليدي على الجليد. أضف ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي H إلى العينة واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، يؤدي الحمض النووي الريبي h إلى تحلل قالب الحمض النووي الريبي تاركا فقط الخيط الفردي CD NA المنتج (كدنا) المكتمل الآن ، مما يتطلب فقط خطوة تنظيف وتركيز إضافية. لعزل منتج CD NA ، قم بإعداد أنبوب جل قفل طور 1.5 مليلتر عن طريق الطرد المركزي عند 12 ، 000 جم لمدة دقيقتين.

يجب أن تكون جميع المواد الهلامية في الجزء السفلي من الأنبوب. أضف 81.5 ميكرولتر من الفينول المشبع ثلاثي المنزحم إلى درجة الحموضة ثماني نقاط لا شيء ، و 81.5 ميكرولتر من 24 إلى كحول أمل من الكلوروفورم والعينة في أنبوب هلام قفل الطور الممزوج عدة مرات عن طريق الطرد المركزي المقلوب اللطيف العينة عند 12 ، 000 جم لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، يجب أن يكون CDNA في المرحلة المائية العليا.

انقل المرحلة العليا ، والتي يجب أن تكون حوالي 20 ميكرولترا إلى أنبوب دقيق نظيف سعة 1.5 مل. لترسيب CDNA ، أضف ميكرولترين من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولار عند درجة الحموضة 5.2 واخلطها برفق. أضف سبعة ميكرولترات من خمسة ملليغرام لكل مليلتر من الجليكوجين واخلطها برفق.

ثم أضف 30 ميكرولترا من الأيزوبروبانول واخلطها برفق واترك العينة تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم جهاز الطرد المركزي عند 12 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، تظهر حبيبات CDNA صغيرة في الجزء السفلي من الأنبوب.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام perpet. اغسل الحبيبات بإضافة 500 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول واخلطها عن طريق الطرد المركزي للعكاس العينة عند 12 ، 000 جم لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة SUP natant مع.

كرر الغسيل وأضف جهاز الطرد المركزي الإيثانول وقم بإزالة SUP natant. بعد الغسيل الثاني ، قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لجمع أي سائل متبقي. قم بإزالة أي سائل زائد واترك الحبيبات تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ثم أضف 20 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز لإعادة ترطيب الحبيبات. ضع العينة على حرارة 55 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. من أجل الإماهة ، يمكن تخزين CD NA عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

أخيرا ، تحقق من كمية ونوعية منتج CD NA باستخدام مقياس الطيف الضوئي ND 1000 بقطرة النانو باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، وينتج عن استخراج وتنظيف الحمض النووي الريبي من 50 جنينا من أسماك الزرد بشكل روتيني ما يقرب من 15 ميكروغراما من الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة كما تم تقييمه باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND 1000 ، ونسبة الامتصاص 60 إلى اثنين 80 حوالي 1.9 إلى نقطتين لا شيء. يتم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام هلام الحمض النووي الريبي المتحول إلى الطبيعة. يظهر الحمض النووي الريبي على شكل مسحة مع شريطين ساطعين يقابلان 18 ثانية و 28 ثانية من الحمض النووي الريبي الريبوزومي.

يجب أن يكون النطاق 28 ثانية أكثر شدة بمرتين تقريبا من النطاق 18 S. بدلا من ذلك ، يتم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي Agilent 2100. تظهر قمتان حادتان تتوافق مع الحمض النووي الريبي الريبوزومي 18 ثانية و 28 ثانية.

يجب أن تكون الذروة 28 ثانية أكبر من ذروة 18 ثانية. ينتج عن النسخ العكسي لخمسة ميكروغرامات من إجمالي الحمض النووي الريبي بشكل روتيني ميكروغرام إلى ميكروغرام من CD NA كما تم تقييمه باستخدام NanoDrop ND 1000. تبلغ نسبة الامتصاص 60 إلى 80 من CDNA حوالي 1.8.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية عزل الحمض النووي الريبي الكلي من أجنة أسماك الزرد الكاملة وتحويل هذا الحمض النووي الريبي إلى منتج CD NA. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على بيئة خالية من RN ais. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.