التصاق وتكدس الصفيحات تحت التدفق باستخدام خلايا تدفق ميكروفلويديك

نظام التدفق الحيوي عبارة عن أداة آلية وجهاز موائع دقيقة لتشغيل فحوصات الخلايا الحية تحت التدفق الهائل المتحكم فيه. يستخدم هذا النظام تقنية الموائع الدقيقة للوحة الآبار لدمج أجهزة خلايا تدفق مقياس ميكرون في ألواح الآبار القياسية SBS. يمكن استخدام BioFlex لإجراء دراسات التصاق وتجميع الصفائح الدموية بإنتاجية عالية وأحجام دم منخفضة.

يضاف الدم الكامل المصنف بصبغة الفلورسنت إلى الآبار ثم يتدفق عبر القنوات. في ظل التدفق الهائل الخاضع للرقابة ، يتم إنتاج بيانات مجهرية عالية الدقة ، والتي تحدد التصاق الصفائح الدموية وتجميعها في وجود مركبات الدواء وغيرها من المعلمات المتفاوتة. مرحبا ، أنا مايك شوارتز من مختبر RD في Flexion Biosciences.

سنعرض لك اليوم إجراء لاستخدام خلايا تدفق الموائع الدقيقة في فحوصات التصاق الصفائح الدموية. نستخدم هذا البروتوكول في مختبرنا لمجموعة متنوعة من فحوصات بيولوجيا الأوعية الدموية. لذلك دعونا نبدأ.

لحم البقر ، قبل إجراء تجربة خلية التدفق ، يجب تحضير قنوات الموائع الدقيقة للوحة التدفق الحيوي بطبقة بروتينية ذات أهمية سيتم استخدام الكولاجين الأول في هذه التجربة. تتصل كل قناة من القنوات التجريبية ال 24 للوحة التدفق الحيوي ببئر مدخل وبئر مخرج لهذه اللوحة. بئر المدخل هو البئر الأيسر الذي يغذي القناة وبئر المخرج على اليمين ، قم بتخفيف مخزون الكولاجين إلى تركيز 200 ميكروغرام لكل ملليلتر.

في حمض الخليك المولي 0.02 ، ستكون هناك حاجة إلى 20 ميكرولتر لكل قناة مستخدمة. نظرا لأن هذه التجربة تتطلب 11 قناة ، اصنع 200 ميكرولتر من طلاء الكولاجين. تظل قناة واحدة غير مطلية ممزوجة بالتكرار اللطيف بطرف ماصة دقيقة.

أضف 20 ميكرولترا من الطلاء إلى كل قناة معنية باستخدام ماصة صغيرة لتوزيع السائل في الثقب الداخلي للبئر. تتضمن تغذية قناة الموائع الدقيقة ذات الأهمية كما هو موضح هنا بالصبغة الصفراء قناة واحدة بدون كولاجين كتحكم سلبي في التصاق الصفائح الدموية وتجميعها. بعد إضافة طلاء الكولاجين إلى جميع القنوات المعنية ، قم بتوصيل الواجهة باللوحة.

إذا كنت تستخدم واجهة bio flux 1000 ، فيمكنك تثبيت كلا المزلاج على المسرح. إذا كنت تستخدم واجهة Bio flux 200 بالإصبع الأول ، فقم بإحكام ربط البراغي الأربعة. وبعد ذلك بمجرد ضبطها بالكامل ، استخدم محرك عزم الدوران لتشديده تماما.

سينقر سائق عزم الدوران عندما يصل إلى الحد الأقصى. باستخدام الوضع اليدوي في برنامج التدفق الحيوي ، قم بتطبيق التروية على القنوات ذات الأهمية عند 2D لكل سنتيمتر مربع من المخرج. حسنا ، استخدم هدفا منخفض الطاقة على المجهر للعثور على بئر المدخل ولاحظ الثقب الداخلي المعاكس مملوء بالسائل.

يجب أن ترى أولا كمية صغيرة من السائل ، تملأ الثقب الداخلي ببطء بعد عدة دقائق وعندما تمتلئ الثقب الداخلي للمدخل ، أوقف الوفرة على جميع القنوات عن طريق الضغط على الإيقاف في البرنامج. احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. خلال فترة الحضانة هذه ، يمكنك البدء في تحضير الدم الكامل في نهاية فترة الحضانة لمدة ساعة واحدة.

بمجرد تحضير الدم ، قم بإزالة الواجهة وأضف ملليلترا واحدا من PBS بالإضافة إلى أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم إلى المخرج. حسنا ، ابدأ الوفرة من بئر المخرج عند اثنين من العشاء في السنتيمتر المربع واستمر في الوفرة لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، أوقف الوفرة بعد إزالة الواجهة ، قم بإزالة PBS الزائد من كل من آبار المدخل والمخرج.

لا تقم أبدا بإزالة السائل الذي يملأ الثقب الداخلي. لحجب القنوات ، أضف ملليلتر واحد من محلول الحظر إلى كل منفذ. حسنا ، ليتم استخدامه من بئر المخرج عند اثنين من العشاء لكل سنتيمتر مربع ويستمر في التروية لمدة 10 دقائق.

أوقف الوفرة بعد 10 دقائق وقم بإزالة الواجهة. القنوات جاهزة الآن ويمكن استخدامها طوال اليوم أثناء طلاء اللوحة بالكولاجين. خلال الحضانة لمدة ساعة واحدة ، يجب تحضير دم بشري جديد من شخص صائم للتصوير وتشغيله في الطبق.

يجب سحب الدم إلى سترات الصوديوم ومضاد للتخثر واستخدامه في غضون ثلاث ساعات من جمعه. أولا ، أضف مخزونا من أربعة ملليمولار من الكالسيوم M في DMSO إلى الدم بتخفيف من واحد إلى 1000 حجم لكل حجم. للحصول على أربعة ميكرومولار الكالسيوم أنا مختلطة عن طريق انعكاس لطيف.

بعد ذلك ، قم بتوزيع مليلتر واحد من الدم المسمى بالكالسيوم في عشرة أنابيب دقيقة من نقطة خمسة مليلتر. أضف GP اثنين B ثلاثة جسم مضاد مثبط إلى كل أنبوب عند التخفيف المطلوب. تأكد من تضمين التحكم السلبي بدون أجسام مضادة وتحكم إيجابي غير ذي صلة بالأجسام المضادة ممزوجا بانعكاس لطيف.

احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، والخلط عن طريق الانعكاس اللطيف كل 10 دقائق قبل إجراء تجربة خلية التدفق. يجب إعداد بروتوكول آلي في وحدة التحكم في التدفق الحيوي للكولاجين. واحد. قم بإعداد بروتوكول لتشغيل الدم على بعد عشرة تسعة سنتيمترات مربعة لمدة 10 دقائق من المخرج.

حسنا ، يجب إعداد معلمات الحصول على بيانات محطة العمل BioFlex 1000 ، والتي تتضمن اكتساب مواقع المرحلة المطلوبة في إعداد الطول الموجي fitz والفاصل الزمني. تشتمل خطة الحصول على الصور النموذجية لهذا البروتوكول من مجال رؤية واحد لكل قناة يتم التقاطها باستخدام هدف 10 × كل 30 ثانية على مدى مدة إجمالية قدرها 10 دقائق. من الممكن أيضا حقول عرض إضافية وإعدادات TimeCept البديلة.

بمجرد إعداد البروتوكول الآلي ومعلمات الحصول على البيانات ، ارجع إلى لوحة BioFlex وقم بإزالة السائل على جانبي القناة باستثناء اللكمات الداخلية. مع الحرص على العمل بسرعة ، ضع 500 ميكرولتر من الدم من كل حالة في آبار الإخراج لكل قناة. لاحظ أن آبار الإخراج تستخدم لتوصيل الدم لأنها أقصر طريق إلى منطقة المشاهدة وستوفر تفاعلا فوريا للدم على طلاء الكولاجين.

بالإضافة إلى ذلك ، ضع الدم الضابط بدون جسم مضاد في قناة مغطاة بالكولاجين وقناة مسدودة للتو. ضع اللوحة على مجهر محطة العمل BioFlex 1000 وقم بتثبيتها على الواجهة. قم بإجراء معايرة قائمة المرحلة عن طريق تحديد نقطة المعايرة الأولى التي يتم تعريفها على أنها الأصل.

ثم حدد موقع نقطة المعايرة الثانية وحدد حددها. قم بتطبيق هذه المعايرة على قائمة المراحل المناسبة. هذا يضمن إمكانية العثور على جميع مواقع المشاهدة على اللوحة تلقائيا.

انقل المرحلة إلى إحدى القنوات التي تحتوي على مجموعة دم تناسب معلمات التقاط الصور مثل وقت التعرض والكسب في برنامج مونتاج BioFlex. قم بتشغيل سير العمل المناسب بالنقر فوق الزر المطلوب. سيبدأ هذا بروتوكول التدفق والحصول على الصور في وقت واحد.

في نهاية التجربة ، قم بإزالة اللوحة من محطة عمل BIOFLU 1000 وتخلص منها وفقا للإرشادات المؤسسية. استخدام قنوات الموائع الدقيقة المطلية بالكولاجين لنظام التدفق الحيوي. لوحظ تكوين الجلطة العدوانية بمرور الوقت مع عينة الدم الضابطة غير المعالجة.

في المقابل ، لم يلاحظ أي تكوين جلطة مع القناة غير المطلية. في إحدى التجارب التي أجريت مؤخرا ، كان متوسط حجم الركام في ظل ظروف التحكم 2000 ميكرومتر مربع. GP two B three A هو وسيط قوي لتفاعلات الصفائح الدموية واستقرار التراكم عند تنشيطه عن طريق الالتصاق بالكولاجين كما هو موضح هنا بعد الحضانة مع المضاد GB اثنين B ثلاثة الجسم المضاد لمدة ساعة واحدة قبل التعرض المطلق ، لوحظ انخفاض في حجم الجلطة بالإضافة إلى انخفاض في تواتر تكوين الجلطة.

يمكن ملاحظة استجابة تعتمد على الجرعة عادة عند عشرة تسعة سنتيمترات مربعة وكانت قيمة IC 50 لهذا المثبط المعين 17 نانومولار. كان الحد الأقصى للتثبيط لهذا المتبرع مقارنة بعدم وجود عنصر تحكم في الأجسام المضادة 11٪ عند 10 سنتيمترات مربعة. تتوفر أيضا لوحة قص عالية 48 بئرا لإجراء تجارب الدم الكامل حتى 200 د لكل سنتيمتر مربع أو 5000 ثانية عكسية.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية استخدام قنوات تدفق الموائع الدقيقة لإجراء تجارب بيولوجيا الأوعية الدموية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. عند القيام بهذا البروتوكول ، من المهم أن تتذكر تخفيف الكولاجين في المخزن المؤقت الصحيح. استخدم دائما تقنية سحب العينات الصحيحة لتجنب إدخال فقاعات الهواء واتبع دائما لوائح السلامة الحيوية الخاصة بمختبرك.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.