Basées sur l'ADN des espèces de poissons protocole d'identification

Le système d’identification des espèces de poissons est une méthode simple, rapide et précise basée sur l’ADN pour identifier les espèces de poissons présentes dans un échantillon donné. Les échantillons de poissons sont traités avec de la protéinase K pour libérer les acides nucléiques dans la solution. L’ADN génomique du poisson est ensuite isolé et amplifié par PCR à l’aide d’amorces qui se lient aux séquences présentes dans tous les génomes de poissons.

Les produits de PCR sont ensuite digérés à l’aide de trois enzymes de restriction différentes et résolus sur le bioanalyseur Agilent 2100. Les longueurs de fragments produites dans les réactions de digestion peuvent être utilisées pour déterminer l’espèce de poisson à l’aide d’un logiciel de restriction de longueur de fragment, de polymorphisme ou de correspondance de motifs RFLP. Bonjour, je m’appelle Rachel Formosa et je vous appelle Agilent Technologies.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’identification des espèces de poissons basée sur l’ADN. Cette procédure est une méthode de dépistage qui vous permet d’identifier les espèces de poissons présentes dans des échantillons frais, congelés, hachés, cuits, séchés ou autrement transformés. Et cela peut être accompli en moins d’une journée de travail.

Nous utilisons cette procédure pour étudier l’authenticité des produits de la mer, ce qui est très important pour l’industrie des produits de la mer, car la substitution et l’étiquetage erroné peuvent avoir des conséquences importantes sur l’économie, l’environnement et la salubrité des aliments. De plus, il peut être particulièrement difficile de déterminer les espèces de poissons par identification visuelle et d’autres méthodes traditionnelles. Une fois qu’un poisson a été traité, les tests ADN fournissent un résultat beaucoup plus précis et fiable.

Alors commençons. Commencez à préparer les échantillons pour l’extraction de l’ADN en plaçant 10 à 1000 milligrammes de chaque échantillon de tissu de poisson cru ou cuit dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre sur chaque poisson. Prélever un échantillon à 220 microlitres de solution de protéinase fraîchement préparée et pipeter de haut en bas.

Incuber les tubes à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes après l’incubation centrifugeuse pendant trois à cinq minutes à 14 000 G pour granuler les tissus non digérés. Ensuite, transférez soigneusement 150 microlitres de chaque surnageant dans un tube frais de 1,5 millilitre, en évitant toute matière non digérée au fond et toute matière huileuse présente en haut. Le surnageant sera maintenant utilisé pour l’extraction de l’ADN génomique.

Commencez l’extraction de l’ADN génomique en ajoutant 500 microlitres de tampon de liaison aux acides nucléiques à chaque échantillon. Cela portera le volume total de l’échantillon à 650 microlitres. Agiter l’échantillon jusqu’à homogénéisation.

Ensuite, transférez chaque échantillon dans une coupelle de centrifugation de liaison à l’ADN qui a été placée dans l’un des tubes réceptacles de deux millilitres fournis dans le kit. Enclenchez le capuchon du tube sur le dessus de la tasse d’essorage. Faites tourner les échantillons pendant une minute à 14 000 G pour charger l’ADN sur la matrice de la coupelle de spin.

Après la centrifugation, retirez les coupelles d’essorage, jetez le filtrat et remettez les coupelles dans les tubes réceptacles. Ajouter 500 microlitres d’un tampon de lavage à haute teneur en sel. Boucher les tubes et centrifuger à nouveau après la centrifugation.

Jetez le filtrat et remettez les coupelles d’essorage dans les tubes de réceptacle. Ajoutez maintenant 500 microlitres d’éthanol à 80 %. Boucher le tube et faire tourner à 14 000 G pendant une minute.

Répétez le lavage à l’éthanol deux fois de plus après le troisième lavage à 80 % d’éthanol, jetez à nouveau les filtrats. Replacez les coupelles d’essorage dans les tubes de réceptacle et cette fois-ci, essorez pendant deux minutes pour sécher la matrice de fibres. Transférez maintenant les gobelets d’essorage dans des tubes de collecte de 1,5 millilitre.

Ajoutez un tampon d’évolution de 100 microlitres à chaque coupelle d’essorage directement sur la matrice de fibres à l’intérieur de la coupelle. Ensuite, enclenchez les bouchons du tube de collecte sur les gobelets d’essorage et incubez-les à température ambiante pendant une minute. Après l’incubation, faites tourner les échantillons à vitesse maximale pendant une minute.

Ensuite, jetez la tasse d’essorage et bouchez les tubes. Si l’on mesure les concentrations d’ADN, on s’attend à des concentrations allant de cinq nanogrammes par microlitre à 500 nanogrammes par microlitre. L’ADN peut maintenant être stocké à quatre degrés Celsius jusqu’à un mois pour un stockage à long terme, placez l’ADN à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius.

Effectuez la PCR à l’aide des amorces et des réactifs fournis dans le kit de réactifs P-C-R-R-F-L-P. Selon le protocole écrit qui l’accompagne, il est recommandé d’analyser chaque échantillon, y compris le contrôle anti no template positif en double pendant l’exécution de la PCR. Préparez des mélanges maîtres d’enzymes de restriction pour les digestions avec DTE E, un, HAE, trois et NL trois, en combinant les composants suivants dans l’ordre, 1,5 microlitre d’eau distillée stérile, 0,5 microlitre de 10 tampon enzymatique et 0,5 microlitre de 10 enzyme.

Préparez suffisamment pour tous les échantillons plus un volume de réaction, un mélange de quatre réactifs en excès. Répartissez ensuite 2,5 microlitres dans chaque tube de réaction étiqueté avec l’échantillon et le nom de l’enzyme. Une fois la PCR terminée, retirez les échantillons du thermocycleur et placez-les sur de la glace.

Ajoutez 2,5 microlitres de chaque produit PCR dans chacun des trois tubes de digestion de restriction pour cette réaction. DDE un HAE trois, et NLA trois. Vortex suivant.

Centrifugez brièvement et incubez les digestions à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Si cela est plus pratique, les digestions peuvent également être incubées pendant la nuit. Après la digestion, incubez les réactions à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ajoutez ensuite un microlitre d’EDTA de 60 millimolaires dans chaque tube pour terminer la réaction et le vortex. À l’aide du kit de réactifs de bioanalyseur Agilent, préparez et chargez la digestion de restriction dans les puits d’une puce à ADN selon le guide du kit. Pour chaque échantillon, les trois résumés doivent être chargés sur la même puce.

Ensuite, vortex la puce et chargez-la dans la machine. Une fois l’exécution terminée, accédez au contexte de test et sélectionnez l’onglet de résumé de la puce. Dans le champ Nom de l’échantillon, entrez un nom d’échantillon pour les 12 puits de la puce afin d’identifier l’espèce de poisson pour les échantillons d’ADN d’essai.

Lancez le programme de décodeur RFLP en cliquant sur fichier. Ouvrez ensuite le fichier XAD. La boîte de dialogue d’ouverture s’ouvre.

Sélectionnez maintenant le fichier XAD pour la puce à ADN utilisée. Et cliquez sur ouvrir pour voir une liste des échantillons chargés sur la puce. Sélectionnez les trois digests correspondant au premier échantillon d’ADN.

Sous la colonne des enzymes, spécifiez les enzymes de restriction qui ont été utilisées dans le champ intitulé Hauteur minimale du pic en pourcentage du marqueur inférieur. La valeur par défaut est de 10 % si nécessaire. Cette valeur peut être abaissée pour identifier les petits pics qui ont été manqués ou augmentée pour éliminer les pics résultant d’un bruit non spécifique dans l’électrophérogramme.

Après avoir ajusté la valeur de la hauteur maximale minimale, cliquez sur Réintégrer. Cliquez maintenant sur calc en bas de la boîte de dialogue. Les données de longueur de fragment obtenues à partir de l’exécution du bioanalyseur rempliront les champs du logiciel.

Ensuite, dans la liste déroulante des scores dans le coin supérieur gauche de l’écran, sélectionnez dés. Si l’échantillon de poisson est constitué d’une seule espèce de poisson ou d’un seul mélange, si l’échantillon peut être constitué d’un mélange, le tableau au bas de l’écran intitulé Liste de scores combinés. Les meilleures espèces correspondent en fonction des résultats des trois réactions de digestion.

Les correspondances parfaites avec un score de un sont surlignées en vert. Les correspondances proches sont surlignées en jaune en haut de l’écran. La valeur limite inférieure désigne la taille minimale du fragment utilisée dans l’analyse, tandis que la valeur de tolérance de correspondance détermine la proximité de la longueur d’un fragment par rapport au fragment prédit pour être considéré comme une correspondance.

La valeur affichée est celle des paramètres par défaut et peut être ajustée. Répétez ces étapes pour l’analyse des échantillons d’ADN restants sur la pointe. Des échantillons d’ADN de quatre espèces de poissons différentes ont été isolés, amplifiés et digérés à l’aide de la méthode décrite dans cette vidéo.

Un gel de bioanalyseur montrant les échantillons de digestion de restriction est présenté ici à l’aide du bio-analyseur Agilent et du décodeur RFLP. Des modèles de flexion logiciels sont utilisés pour identifier le poisson ici. Le premier échantillon est correctement identifié comme étant de la truite, le deuxième comme du thon, le troisième comme de la terre rocheuse.

Et le dernier échantillon en tant que cabillaud spécifique. Nous venons de vous montrer comment effectuer l’identification des espèces de poissons basée sur l’ADN à l’aide de la méthode P-C-R-R-F-L-P d’agilent. Lors de cette procédure, il est important d’éviter la contamination croisée des échantillons car la méthode est très sensible.

Donc c’est tout. Vous savez maintenant comment identifier rapidement, facilement et avec précision les espèces de poissons présentes dans vos échantillons. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.