Name: תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למד שיטות תרבית אורגנוטיפיות של רשתית ארנב למבוגרים והעברת גנים באמצעות פלסמידים המקודדים ל-GFP. שיטה זו מאפשרת חקר תאי גנגליון רטינליים ותהליכים תת-תאיים בביולוגיה עינית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

הכנת כדורי אקדח גנים (GOLD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 100x PVP (0.5mg/ml) ב EtOH 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 30mg זהב BioRad 1.6 מיקרון microcarrier ומקום אותו לתוך צינור Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות פלסמיד צריך לתת ריכוז של 0.5-3 מיקרוגרם זהב פלסמיד / מ&quot;ג, והמקום הפלסמיד לתוך הצינור עם microcarriers זהב. שלב פלסמידים מספר במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו נפח פלסמיד ל μl 100 עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של spermidine 0.05M לתוך הצינור. וורטקס צינור 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס 1 דקה במלוא המהירות. Sonicate במשך 3-5 דקות .. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש אורך מתאים של צינורות Tefzel במנגנון PDS-1000/He Biorad במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר sonication, מערבולת של 1-2 דקות במהירות מלאה. הפחת את מהירות לאט, כדי לאפשר את הצינור להיפתח בעוד vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של 1 M CaCl 2 לאט להפיל את צינור חכם בעוד vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר צינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 5 מיקרון המסנן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח שני מזרקים 5 מ&quot;ל ללא מחטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבוכנה, ולנתק את כומתות שחורות. לוקח מספריים קטנים, מנותקים חלק הכובע השחור לתת טבעת. חזור על הבוכנה השני שתי טבעות נטו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כריך 5 מיקרון (חלקים קטנים, Inc ניילון לסנן, בקוטר ½ אינץ&#39;) מסנן בין שתי טבעות, ולדחוף את הכריך לתוך קצה המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתלשל מזרק על בקבוק 50 מ&quot;ל קונית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, מערבולת הצינור למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור למשך 30 שניות ולשמור את גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של EtOH 100% גלולה. השתמש קצה פיפטה כדי לשבור את גלולה, והמערבולת 30 שניות. ספין 30 שניות ולהסיר EtOH. חזור על 2 יותר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של EtOH 100% על גלולה (להיפרד קצה). המקום הזה בתוך 5 מיקרון מסנן ולתת לו לזרום דרך על ידי כוח המשיכה לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל חרוטי. השתמש EtOH נוספים במידת הצורך לשטוף את הצינורית או לעזור עם לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין שפופרת 50 מ&quot;ל ב 2000rpm בצנטריפוגה למשך 5-10 דקות. הסר supernatant, לשמור גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לצפיפות הרצויה של microcarriers הצורך, להוסיף 800μl-1.5ml EtOH 100% המקביל 8 μl-15 μl פתרון PVP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ומיד ללכת למנגנון PDS-1000/He Biorad. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biorad מנגנון PDS-1000/He <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את הצינור המחבר בין מיכל הדלק לצינור N2 הייבוש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את ייבוש צינורות Tefzel ממכונה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה אחד לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל חרוטי, ולצרף מזרק לקצה השני של הצינור. תמצצי slurry חום לאמצע הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בחזרה צינורות לתוך המכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו (ללא סיבוב) עבור 4 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 דקות, למצוץ את EtOH לאט ובזהירות, כדי לוודא שלא להפריע microcarriers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את צינורות דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי דקה 1, לחבר את הצינור המחבר את מיכל הגז N 2 הצינור ייבוש ולתת צינורות יבש במשך 15 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דקות, לחתוך את צינורות בגודל כדור לשמש מיד או מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס exsiccator. תבליטים ניתן לאחסן עד 3 חודשים. </li></ol> הכנת נשק גן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום כדורים במחסנית. כל תכשיט של הרשתית ניתן נורה בכדורים 1-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחסנית לתוך הנשק הגן ולצרף את האקדח למקור הליום. הגדר את הלחץ 110 psi. </li></ol> הכנה של התקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection בינוני <table style="width: 229px; height: 157px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><td> 1 בקבוק איימס פתרון (Sigma, 8.8g) </td></tr><tr><td> 1.9 גרם סודיום ביקרבונט </td></tr><tr><td> עט 10 מ&quot;ל 1% / סטרפטוקוקוס / L-גלוטמין (1:100) (Gibco / Invitrogen) </td></tr><tr><td> 990 מ&quot;ל מים מזוקקים עד 1 ליטר </td></tr><tr><td> ------------------------------- </td></tr><tr><td> 1 ליטר </td></tr></tbody></table> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון בינוני לנתיחה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני דגירה (500ml) <table style="width: 283px; height: 157px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><td> 485 מ&quot;ל של התקשורת לנתיחה מסוננים </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל של תוספת 1% N2 (Gibco / Invitrogen) </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל סרום סוס 1% (Sigma) </td></tr><tr><td> 500 μl של פנול אדום </td></tr><tr><td> -------------------------------------------------- - </td></tr><tr><td> 0.5 ליטר </td></tr></tbody></table> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון בינוני הדגירה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבועה 2 O לתוך המדיום לנתיחה במשך 15 דקות לפני תחילת פרוטוקול קצירת הרשתית. </li></ol> הכנת בתאי הדגירה של הרשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע, למלא מספר 60 מנות עמוק מ&quot;מ (בתאי הדגירה, Nunc) עם 25 מ&quot;ל של מדיום הדגירה. מספר המנות תלוי במספר של retאינאס הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לעמוד לסנן לתוך כל מנה עמוק. רק עצות מאוד לעמוד לא צריך להיות שקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את כל הכלים עמוק לתוך החממה עד הרשתיות מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא שני 100 מ&quot;מ בצלחות פטרי ומביאים הספסל לנתיחה. </li></ol> הכנה של הרשתית ארנב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן ארנב על פי פרוטוקולים הוקמה. להלן אינו חייב להתבצע מתחת למכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים זוויתי, להכניס אותו מאחורי העין לתוך ארובת העין של הארנב, חיתוך ממברנות עצב אופטי המצורפים העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בעדינות את העין לשטוף אותו עם התקשורת לנתיחה מחומצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העין (קרנית כלפי מעלה) לתוך הבאר של מבצעה עין ולסגור את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את להב אופקית ממש מתחת למכסה. בתנועה חלקה אחת, לצייר את הלהב על פני העין לחתוך את הקרנית, משאיר כוס העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את הרשתית של העין מבצעה היטב ומניחים אותו על נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזגוגית ואת העדשה על ידי לחיצה על אזור ליד עצב הראייה הכרות ומושך אחורה על נייר הסינון. חזור מספר פעמים עד כמעט את כל הזגוגית היא להסיר את הגביע עין נראה מרוקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עין כוס לתוך צלחת פטרי עם התקשורת לנתיחה כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את כוס עין אל המספר הרצוי של החלקים (5 חלקים לכל היותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו חתיכה אחת של כוס עין ולשים אותו מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלאמפ בלובן העין ו דמית העין קלות יחד על קצה של הרשתית באמצעות מלקחיים. עם זאת, להשתמש במברשת בסדר לצחצח נכון בין דמית העין לבין הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתנועות עדינות קצר, להקניט את הרשתית דמית העין עד שהוא הופך להיות מנותקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 1 ס&quot;מ מעל פיפטה העברה סטרילית. השתמש למצוץ את הרשתית ואת המקום לתוך צלחת פטרי של המדיום הדגירה לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה אחרת להעביר סטרילי עם 1 אינץ לחתוך בזהירות להעביר את הרשתית על 0.4 מיקרומטר Millicell המסנן (Millipore, חתול לא: PICMORG50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו במברשת כדי לכוון את הרשתית עם הצד הגנגליון התא כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטחו את הרשתית על ידי הברשה קלה בשולי הרשתית. מזעור נגיעה תא גנגליון שכבה עם מברשת כמה שיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני עודף על מסנן עם פיפטה העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להעביר את המסנן על suctioner שונה. צייר על suctioner 2-3 פעמים כדי להסיר את כל מדיום הדגירה של המסנן. </li></ol> ג&#39;ין gunning ו הדגירה של הרשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע, מקום אחד הרשתית המכילים מסנני-עומד על מסנן 60 מנות עמוק מ&quot;מ (בתאי הדגירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי המדיום הוא במגע עם החלק התחתון של המסנן וכי בינוני לא לגלוש לצדדים של המסנן על הרשתית. המסנן לפעול כממשק בין הרשתית ובינוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תירה כל פיסת הרשתית עם שני כדורים. מקום אקדח גן ישירות מעל רקמות, על 3-4 ס&quot;מ ממנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את כל חדרי הדגירה על שייקר של 35-37 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני הדגירה מדי יום. הרשתית ניתן מודגרות לתקופה מקסימלית של 6 ימים. </li></ol>

<ol><li>Landreth,, Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+adult+goldfish+retina%3A+a+model+for+the+study+of+CNS+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration.</a> Brain Res. 161, 39-55 (1979).</li>
<li>Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ganglion+cells+and+their+axons+in+organized+cultures+of+fetal+mouse+retinal+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants.</a> Brain Res. 204, 159-178 (1981).</li>
<li>Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+cytochemical+identification+of+neuronal+and+non-neuronal+cells+in+chick+embryo+retina+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures.</a> Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).</li>
<li>Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-bungarotoxin-induced+cell-death+of+neurons+in+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina.</a> Brain Res. 250, 309-319 (1982).</li>
<li>Kim, S. U., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+study+of+adult+human+retina+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue culture study of adult human retina neurons.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).</li>
<li>Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor-specific+protein+expression+of+mouse+retina+in+organ+culture+and+retardation+of+rd+degeneration+in+vitro+by+a+combination+of+basic+fibroblast+and+nerve+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors.</a> Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).</li>
<li>Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+growth+rates+of+bovine+retinal+and+brain+microvascular+pericytes+in+different+oxygen+concentrations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+N+Z+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro.</a> Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).</li>
<li>Seigel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+golden+age+of+retinal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The golden age of retinal cell culture.</a> Mol Vis. 5, 4(1999).</li>
<li>Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+retina+explants+after+long-term+culture+in+serum+free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium.</a> J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).</li>
<li>Hatakeyama, J., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+to+retinal+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants.</a> Methods. 28, 387-395 (2002).</li>
<li>Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((issue+culture+studies+of+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">issue culture studies of retinal development.</a> Methods. 28, 439-447 (2002).</li>
<li>Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+differentiation+in+cultured+mouse+retinal+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants.</a> Methods. 28, 448-456 (2002).</li>
<li>Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math3+and+NeuroD+regulate+amacrine+cell+fate+specification+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina.</a> Development. 129, 831-842 (2002).</li>
<li>Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+primary+culture+technique+for+adult+retina+allows+for+evaluation+of+CNS+axon+regeneration+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents.</a> J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).</li>
<li>Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+neurospheres+prepared+as+tissue+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation.</a> Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).</li>
<li>Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+vitality+in+organotypic+cultures+of+mature+vertebrate+retinas+validated+by+light-dependent+molecular+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements.</a> Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).</li>
<li>Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+culture+model+of+the+postnatal+mouse+retina+allows+the+study+of+glutamate-mediated+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity.</a> J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).</li>
<li>Johnston, S. A., Tang, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+microparticle+injection+to+introduce+genes+into+animal+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo.</a> Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).</li>
<li>Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transfection+in+brain+slices+using+particle-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer.</a> Neuron. 13, 1263-1268 (1994).</li>
<li>Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+and+translation+of+in+vitro+synthesized+messenger+RNAs+in+transfected%2C+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells.</a> J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci STKE. 2000, (2000).</li>
<li>Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%22DiOlistic%22+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+gun-mediated+DNA+delivery+into+rodent+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).</li>
<li>Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+transfection+of+lamprey+brain+neurons+by+gene+gun+delivery+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA.</a> Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).</li>
<li>Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+particle+mediated+delivery+of+mRNA+to+mammalian+tissues%3A+ballistic+and+biologic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regeneration%22%5BJournal%5D)">In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects.</a> Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+and+morphological+analysis+of+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons.</a> J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).</li>
<li>Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+dynamics+in+the+nervous+system+by+means+of+ballistic+delivery+of+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators.</a> J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).</li>
<li>Gamper, N., Shapiro, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+modulation+of+M-type+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels.</a> J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).</li>
<li>Wirth, M. J., Wahle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+organotypic+cultures+of+rat+visual+cortex+using+a+handheld+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device.</a> J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).</li>
<li>O'Brien, J., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+and+diolistic+transfection%3A+using+the+gene+gun+to+deliver+DNA+and+lipophilic+dyes+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells.</a> Methods. 33, 121-125 (2004).</li>
<li>Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+labeling+and+dynamic+imaging+of+astrocytes+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).</li>
<li>Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+receptor+transcription+factor%2C+retinoid-related+orphan+receptor+beta%2C+regulates+retinal+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation.</a> Mech Dev. 77, 149-164 (1998).</li>
<li>Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+ganglion+cells+in+a+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diversity of ganglion cells in a mammalian retina.</a> J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).</li>
<li>Sun, W., Li, N., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+morphological+survey+of+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells.</a> J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).</li>
<li>Sun, W., Li, N., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+morophological+survey+of+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).</li>
<li>Stacy, R. C., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+relationship+between+cholinergic+amacrine+cell+processes+and+ganglion+cell+dendrites+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).</li>
<li>Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+second-order+neurons+in+the+retina+of+rd%2Frd+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice.</a> Vision Res. 43, 867-877 (2003).</li>
<li>Pignatelli, V., Strettoi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolar+cells+of+the+mouse+retina%3A+a+gene+gun%2C+morphological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study.</a> J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).</li>
<li>Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+morphological+classification+of+horizontal%2C+bipolar%2C+and+amacrine+cells+within+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina.</a> J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).</li>
<li>Edqvist, P. H., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+horizontal+cells+migrate+bi-directionally+across+the+neuroepithelium+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development.</a> Development. 131, 1343-1351 (2004).</li>
<li>Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+degeneration+is+topological+but+not+cell+type+specific+in+DBA%2F2J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice.</a> J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).</li>
<li>Qin, Y., Xu, G., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+abnormalities+in+retinal+ganglion+cells+of+three-month+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats.</a> Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).</li>
<li>Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobiolistic+delivery+of+indicators+to+the+living+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina.</a> J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).</li>
<li>Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+physiologically+functional+adult+Mammalian+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas.</a> PLoS ONE. 2, e221(2007).</li>
</ol>

1. מה אני יכול לעשות עם השיטה הזאת? <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה מורפולוגיה תא בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל תאים להקליט אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Overexpress חלבונים, כמו PSD95, אלא גם חלבונים אחרים כי לווסת את תגובת התא, תעלות יונים למשל, קולטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספרס RNAs מעכבות. </li></ul> ...

תרבות organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

מערכות תרבות Organotypic של רקמות עצביות תפקודית הם כלי חשוב במחקר הנוירוביולוגי. באופן אידיאלי, מערכת כזו צריכה להיות תואמת שיטות הדמיה, מניפולציה גנטית, הקלטה אלקטרו. כאן אנו מציגים שלבי הביניים פשוט רקמת תרבות מערכת רשתית ארנב מבוגר שאינו דורש ציוד מיוחד ותחזוקה מעט מאוד. אנו מדגימים את לנתיחה ו הדגירה של הרשתית ארנב החלקיקים בתיווך העברת גנים של פלסמידים או קידוד ה-GFP מגוון רחב של סמנים subcellular לתאי הגנגליון ברשתית. הרשתיות הארנב תרבותי בדרך זו ניתן לשמור אותן בחיים עד 6 ימים עם מעט מאוד שינויים של המבנה האנטומי הכוללת או את המורפולוגיה של הפרט גנגליון, תאים amacrine.

מאמר זה מדגים את לנתיחה ו הדגירה של הרשתית ארנב החלקיקים בתיווך העברת גנים של פלסמידים או קידוד ה-GFP מגוון רחב של סמנים subcellular לתאי הגנגליון ברשתית.

תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

מערכות תרבית אורגנוטיפיות של רקמות עצביות תפקודיות הן כלים חשובים במחקר נוירוביולוגי. באופן אידיאלי, מערכת כזו צריכה להיות תואמת ל...

שלום, שמי הוא, והיום אראה לכם את שיטות האינקובציה של רשתית ארנב בוגרת ואת הגן העוקב. נהדר. שטיפה של מספר סימנים. אני חושב שזה גם מייבש את הרשתית.כן, זה נכון. זה נכון, זה נכון. כן. אז אתה מתכוון שזה סופח את כל המים מהתא, כך שהוא מתייבש.כן, אני חושב, כן. אז רקמה, זה בסדר. האם אתה... אה, זה בסדר.זה בסדר. אז עכשיו נניח את הצד של הלהקה כלפי מעלה בחזית. קודם כל, בואו נציג את עצמנו.כן, אני טיאנה. אני אמרי. כבר נפגשתם. כן.אם כן, מה ניתן לעשות באמצעות שיטה זו? ובכן, ניתן לתרבד זברים (zebrafish) בוגרים. ומכיוון שניתן גם להשתמש ברובה גנים (gene gun) ולהביע, למשל, GFP, השיטה שימושית מאוד לצפייה ברורה במורפולוגיה של תאי חורש (sickle cells).ניתן לבצע בדיקות אנטומיות על תאים אלו, או לסמן תאים באמצעות DS red או GFP כדי לאתר אותם להקלטה מאוחרת, למשל הקלטת זרמי אמפ (amp recording). ניתן גם לבטא, למשל, חלבונים המסמנים סינפסות כגון PSD 95 GFP, וכן חלבונים אחרים שייתכן שתרצו לחקור ברשתית, כגון תעלות יונים. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לבטא RNA מעכב. כן.אז מהן המגבלות של שיטה זו? ובכן, אני חושב שהחשובה ביותר היא כנראה הזמן. לא ניתן לשמור את הרשתית למשך יותר משישה ימים. הייתי אומר שאנו כבר לא סומכים על הרשתית לאחר שישה ימים.זה קורה בגלל פיזור מעורב, כנראה. וכעת, אם אתם רק רוצים לבטא GFP, שמופיע לאחר 24 או

organotypic-culture-of-adult-rabbit-retina

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מדגים וידאו הקמת organotypic תרבויות wholemount הרשתית הליך cytospin לניתוח תופעות המושרה exogenously. Organotypic תרבויות wholemount רשתית לחקות...

בשנת vivo, כמו תרבות Wholemount Murine Organotypic רשתית

כאן אנו מתארים שיטה חסכונית לתרבות organotypic של הרשתית חזירי הבוגרת במשך שבעה ימים. בקצרה, נייר סינון סטרילי שימש להרים את הרשתית העצבית מן הרשתית ואת photoreceptor מקום על הצד להוסיף שהעלו לעמוד מחוייט.

תרבות Organotypic של הרשתית מלא עובי למבוגרים חזירי

רשתית עצבית של עכבר בגילים 8 ימים היא על גבי בלוק ג'לטין 4%. לאחר הבידוד של שכבת קולטי האור (200 מיקרומטר) על ידי vibratome, הקולטניים האור הם זורעים לאחר ניתוק מכאני והאנזימטית לתרבות. שכבת קולטי האור יכולה לשמש ל, ניתוחים ביוכימיים מולקולריים או השתלה.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) אסטרטגיות החלפה וטיפול מבוססי גנים נחשבים במשך כמה תנאים ניווניות ברשתית. לתרגום קליני, במודלים של בעלי חי עין גדולים נדרשים ללמוד טכניקות ניתוחיות בחולים ישימות. כאן אנו מציגים מודל ארנב לניתוח subretinal המיועד השתלת רשתית, אשר היא תכליתי וחסכוני.

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את culturing תאי (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, על הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך. שיטה זו מתאימה ללמוד RPE בהתנהגות התא על מטריצה חוץ-תאית פרוץ.

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

הפרוטוקול מתאר explants organotypic שלרשתית נוירוהעכבר , מעובד יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית שלה (RPE), במדיום R16 מוגדר, ללא סרום ואנטיביוטיקה. שיטה זו פשוטה יחסית לביצוע, זולה יותר וגוזלת זמן בהשוואה לניסויי vivo, וניתן להתאים אותה ליישומים ניסיוניים רבים.

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להשגת קריוסקציות באיכות גבוהה של עיני ארנב שלמות. הוא מפרט את הליכי הדיסקציה, הקיבוע, ההטבעה והחתך של עין הארנב, אשר עשויים להיות מותאמים בקלות לשימוש בכל מחקר המשתמש באימונוהיסטוכימיה בעיניים גדולות יותר.

השגת קריוקציות באיכות גבוהה של עין ארנב שלמה 

פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

למד שיטות תרבית אורגנוטיפיות של רשתית ארנב למבוגרים והעברת גנים באמצעות פלסמידים המקודדים ל-GFP. שיטה זו מאפשרת חקר תאי גנגליון רטינליים ותהליכים תת-תאיים בביולוגיה עינית.

תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

גלה סרטונים נוספים