Name: ヘッドオンRNAポリメラーゼによって停止した複製フォークの再起動を指示する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶヘッドオンRNAポリメラーゼとの衝突後の複製フォークの運命。MfdによるRNAPの排除と複製再開のメカニズムを解明し、DNA複製と転写の相互作用を理解する。

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我々は、RNAPとMFDタンパク質および発現ベクターを提供するためのセスダーストに特に感謝しています。我々はまた、技術サポートのためにGreBとダン張を提供するためのセルゲイBorukhovに感謝している。この作品は、国立衛生研究所（MOD）からの助成金によって、ロックフェラー大学（RTP）でマリー=ジョゼとヘンリークラビスフェローシップでサポートされていました。

このメソッドは、で報告された研究で使用され<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">ポメランツとオドネル、科学327、590〜592（2010） 。</a> 1。停止RNAPの伸長複合体のアセンブリは、以下のように行った： E.の500nMの最終濃度大腸菌の RNAポリメラーゼは、HEがバッファー100μl中T7A1プロモーター（20mMのトリス- Cl（pH7.5）中、8 mMのMgCl 2、0.5mMのEDTA、5を含むビオチン化3.6キロバイトのDNAテンプレートの5nMの最終濃度と混合された70、σ 37℃で10分のためmMのDTT、10％グリセロール） APUの100μMおよび40μMGTP、ATP、およびCTPのそれぞれが37℃でさらに10分間添加した℃、 2。ストレプトアビジンビーズ上に停止したRNAポリメラーゼの伸長複合体の固定化は、以下のように行った： ストレプトアビジン磁気コーティングされたビーズ（Invitrogen社）を200μl室温で10分間、上記の反応に加えた。 3。固定化停止RNAPの伸長複合体の精製は以下のように行った： ビーズ（上記から）、次のバッファ0.9 mLで含む、0.75MのNaCl、200μg/ mlのヘパリン、および20μg/ mlのssDNAを（上清を磁気分離することにより、各洗浄ステップの後に削除されました。）5回洗浄し、ビーズを緩衝液Aの0.9 mlで2回洗浄し、 4。 ：に正面からRNAP次のように実行された下流の相対的な複製フォークの形成ビーズ（上記から）ニューイングランドバイオラボバッファ4と樹液私の10ユニット（New England Biolabs社）100μlに再懸濁し37℃で10分間追加されました℃にビーズをバッファー0.9 mLで3回洗浄し、次にクイックT4ライゲーション反応バッファー（New England Biolabs社）を50μlに再懸濁した。クイックT4リガーゼ（New England Biolabs）2μlを室温で10分間プレアニーリングしたフォークDNAの6nmの最終濃度（RP10、RP22、RP25）と一緒に追加されました。ビーズを緩衝液Aの0.9 mlで3回洗浄し、 5。複製フォークでreplisomeとリーディング鎖合成の開始のアセンブリは、以下のように行った： DnaB 448 pmolのは（量体として）30秒のバッファを150μl（20mMのトリス- Cl（pH7.5）中、8 mMのMgCl 2、0.5mMのEDTA、5mMのDTT、10％グリセロール）でビーズとインキュベートした23℃ポリメラーゼIIIの4.9 pmolの*（はPol III HEマイナスβ）、βの15 pmolの、2mMのATP、60μMdGTP及びdATPのそれぞれを200μlの体積に添加し、37でさらに5分間℃にインキュベートした。レプリケーションは、と一緒に10μgのSSBと24μMのdATPとdTTPの各々を加えることにより開始された[α- 32 P] dTTPのと[α- 32 P] dCTPを（特定の活動、3,000〜5,000 CPM / pmol）を250の最終容量にμL。反応は、500mMのEDTA 12μLを加える時に10分後に終了した。 6。放射性標識DNA産物の精製および濃縮は次のように行った： 反応は、ビーズからDNAを除去するために終了した後、ビーズを（上から）煮沸した。ビーズに接続されている残っている残存DNAを50℃で30分間、10 ulのボリュームでプロテイナーゼKとビーズを処理することにより削除されました℃にビーズを沸騰させ、上清を磁気分離により除去した。 DNAを含む組み合わせて上清をQiagen PCRクリーンアップキットを用いて精製した。精製された放射性標識DNA産物をアルカリアガロースゲルで分析した。 ヘッドオンRNAP伸長複合体が上記のように実行された停止、しかし、σ70の存在下で*レプリケーションが省略されていました。 代表的な結果： とreplisomeの正面衝突でRNAP通常2.5 kbおよび長さは3.6 kbの二つの製品につながる。 2.5キロバイトの製品は、フォークから停止RNAPとRNAポリメラーゼとの衝突時に失速replisomeから結果へのDNAの長さを表します。 3.6キロバイトの製品は、不完全なRNAPによるプロモーターの占有または部分的replisomeヘッドオンRNAPのリードスルーのどちらかから完全長のDNAとの結果を表しています。いいや、正確な結果が約50％の完全長DNAが生成されていることを示しています。ただし、場合によっては、RNAPによるプロモーターの少ない占有が発生し、replisomesの大きい人口がヘッドオンRNAPが発生しないので、完全長のDNAの割合が高いが観察される。唯一の完全長DNA（3.6 KB）の停止RNAPの結果がない場合に複製。 <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="図1"> 図。 1 replisomeは、ヘッドオンRNAPによって妨げられている。 （A）実験のセットアップ。 E.コル私は停止伸長複合体は、前述のようにT7A1プロモーターを含むビオチン化DNA（9）にアセンブルされたRNAP。簡単に言えば、停止伸長複合体は、さらに10分間APU、GTP、ATP、およびCTPを加えて10分間、ビオチン化DNAとRNAポリメラーゼホロ酵素をインキュベートすることにより、プロモーターから20 bpsの下流に形成された。ストレプトアビジンビーズは、ビーズをバッファー0.9 mlのは、不安定なRNAP - DNA複合体と過剰のNTP削除するには、0.75MのNaCl、200 mg / mlのヘパリン、および100nMの一本鎖DNAを含むで5回それぞれ洗浄し、さらに10分間追加されました。 DNAを洗浄し、SAPIで消化し、プレアニーリングしたフォークDNAに連結した。ビーズをreplisomeの組み立て前に再度洗浄した。プロモーターは、フォークから2.5 kbの位置とフォークに向かって直接転写を指向しているさ。DnaBが追加された（B）その後replisomeがアセンブルされ、複製が存在する（レーン2）または非存在下（レーン1）のいずれかで開始されたヘッドオンRNAP。

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</ol>

高塩濃度でビーズに結合した停止伸長複合体を洗濯しても不安定になったり、非特異的に結合したRNAポリメラーゼの分子を除去するために重要です。 RNAPは、プライマーとテンプレートの型のDNA構造のための非常に高い親和性を持っています。したがって、プライマーテンプレートから複製を実行するために、そのような非特異的RNAP - DNA複合体を除去する必要がある。キアゲンPCR精製キットを用いて放射性標識DNA産物を集中するとゲルで観察することができる十分に高い放射性シグナルを得るためにも重要です。

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Quick Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

ヘッドオンrnaポリメラーゼによって停止した複製フォークの再起動を指示する

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

in vivo試験で複製フォークが原因でヘッドオン転写複合体との遭遇に逮捕されていることを示唆している。まだ、正面衝突に続くreplisomeとRNAポリメラーゼ（RNAP）の運命は不明である。ここで、我々は見つけることE.大腸菌ヘッドオン転写複合体ではなく、崩壊のとの衝突時にreplisome屋台は、複製フォークでは非常に安定していると最終的にDNAからRNAポリメラーゼを置換した後、伸長を再開します。我々は、転写修復カップリング係数、MFDが、RNAPの変位を容易にすることによって衝突の後のフォークの直接の再起動を促進することをも見つける。これらの知見は、複製装置の固有の安定性とRNAPのブロックを越えて複製を促進する転写共役修復経路のための新たな役割を示しています。

ヘッドオンRNAポリメラーゼ（RNAP）との衝突に続くreplisomeの運命は不明である。我々は、DNAからRNAポリメラーゼを置換した後、伸長をreplisomeヘッドオンRNAPとの衝突時に屋台が、再開することを見つける。 MFDは、衝突後のRNAPの変位を容易にすることによって、レプリケーションの再起動を促進する。

ヘッドオンRNAポリメラーゼによって停止した複製フォークの再起動を指示する

in vivo 研究により、複製フォークは転写複合体と正面衝突することで停止することが示唆されています。しかし、レプリソームおよびRNA...

この手順の全体的な目的は、正面衝突後のRepli zoneおよびRNAポリメラーゼ（RNAP）の運命を観察することである。まず、ビオチン化DNA上で転写複合体を構築し、それをStrippタブレットおよびビーズ上に固定することで、RNAP伸長複合体を停止させる。次に、このRNAP伸長複合体に事前に準備したフォーク状DNAをライゲーションし、正面衝突するRNAPの下流に複製フォークを形成させる。手順の第3ステップは、repli zoneを構築し、複製フォークにおいてリーディング鎖の合成を開始することです。手順の最終ステップは、磁気ビーズからDNAを回収し、PCR精製カラムを用いてDNAを精製することです。最終的に、精製した放射標識DNA産物のアルカリアガロースゲル電気泳動を通じて、rosoが正面衝突型の転写複合体に衝突して停止することを示す結果を得ることができます。こんにちは。ロックフェラー大学のMike O'Donnell研究室のリチャード・ポメランスです。本日は、固相におけるリボソームとRNAポリメラーゼの正面衝突を再現する手順をご紹介します。当研究室では、DNA上の転写複合体が複製プロセスにどのような影響を与えるかを研究するために、この手法を用いています。それでは始めましょう。このプロトコールの最初の手順として、T7 A1プロモーターを含むビオチン化された3.6 KB DNAテンプレートとRNAPホロ酵素を、100 µLのバッファーA中で混合し、この混合液を37 °Cで10分間インキュベートします。10分間のインキュベーション後、リボヌクレオチドのアデノシン三リン酸、シチジン三リン酸、およびウリジン三リン酸を添加します。これにより、RNA合成を20ヌクレオチドに制限します。停止したRN ape伸長複合体をビーズ上に固定するため、溶液を37 °Cでさらに10分間インキュベートします。この溶液をストレプトアビジンコート磁気ビーズに加えます。混合物を室温で10分間インキュベートしてください。0.9 mLの高塩濃度バッファーでビーズを洗浄し、固定化された停止RNAP伸長複合体を精製します。各洗浄後、磁気分離により上清を除去して、非特異的なR-N-A-P-D-N-A複合体を取り除きます。この洗浄を5回繰り返してください。次に、ビーズを0.9 millilitersのバッファーAでさらに2回洗浄します。最終洗浄後、停止したRNAP伸長複合体に結合したビーズを、100 microlitersのNew England Biolabsバッファー4に懸濁させ、マグネットストリップで回収して、RNAPのヘッドオン方向の下流に複製フォークを構築します。次に、10 unitsのシュリンプアルカリホスファターゼ（SAP）を添加し、サンプルを37 degrees Celsiusで10分間インキュベートします。ビーズを0.9 millilitersのバッファーAで3回洗浄します。その後、ビーズを50 microlitersのQuick T4ライゲーション反応バッファーに再懸濁します。2 µLのQuick T4 ligaseとpre-need forked DNAを加え、室温で10分間インキュベートします。最後に、0.9 mLのバッファーAでビーズをさらに3回洗浄し、停止したRNAP伸長複合体および下流の複製フォークに結合した磁性Strep Aビーズに、ヘキサマーDNAヘリカーゼを混合します。この溶液を150 µLのバッファーAで調製し、23 °Cで30秒間インキュベートします。23°Cでの短時間の32回目インキュベーションの後、polymerase three beta clamp、A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P、α-P³²標識dGTPおよびα-P³²標識dATPを加え、全量を200 µLにします。サンプルを37°Cで5分間インキュベートします。単鎖DNA結合タンパク質、DCTP、およびDTTPを添加して複製を開始します。また、$\alpha$-$^{32}$P標識DTTPおよびDCTPを加え、最終容量を250 µLにします。10分後、0.5 M EDTAを12 µL添加して反応を停止させます。次に、stC-dinビーズを沸騰させ、ビーズからDNAを放出させます。50 °Cで30分間プロテイナーゼKで処理し、残留DNAを除去します。再度ビーズを沸騰させ、磁気分離によって上清を除去します。Kyogen PCR cleanup kitを用いて、DNAを含む回収した上清を精製します。最後に、精製した放射標識DNA産物をアルカリアガロースゲルで分析します。通常、複製フォークがRNAPに正面衝突すると、2.5 KBおよび3.6 KBの長さの2つの産物が生成されます。2.5 KBの産物は、フォークから停止したRNAPまでのDNAの長さを表しています。これは、RNAPとの衝突によりレプリソームが停止した結果生じます。3.6 KBの産物はフルレングスのDNAであり、RNAPによるプロモーターの占有が不完全であるか、あるいは前方衝突したRNAPをレプリソームが部分的に読み飛ばした結果生じます。良好な結果では、約50%のフルレングスDNAが生成されます。しかし、場合によっては、RNAPによるプロモーターの占有率が低下し、フルレングスのDNAの割合が高くなることがあります。これは、停止したRNAPが存在しない場合、より多くのレプリケーションゾーンがRNAPとの正面衝突を起こさず、結果としてフルレングスのDNAのみが得られるためです。ここでは、DNAに結合した停止状態のRNAポリメラーゼ伸長複合体が存在する場合に、レプリケーションおよび固相法を行う方法について説明しました。この手順を行う際は、DNAに非特異的に結合してレプリケーションを阻害する過剰なRNAポリメラーゼを除去するため、停止した転写複合体を高塩濃度で洗浄することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っております。

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サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; E。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

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