Name: 电离辐射的反应定量的γH2AX灶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学习利用免疫荧光技术定量检测γH2AX灶，评估电离辐射诱导的人细胞DNA双链断裂损伤。该方法可监测初始DNA损伤及修复过程，适用于放射增敏剂和防护剂的效果评价。

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感谢澳大利亚核科学与工程研究所的支持。TCK 获得了 AINSE 奖项资助。表观基因组医学实验室由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（566559）资助。LM 获得了墨尔本研究奖学金（墨尔本大学）和生物医学影像合作研究中心补充奖学金的支持。莫纳什显微成像中心（Stephen Cody 博士和 Iśka Carmichael 博士）为本研究提供了 invaluable 的支持。

细胞制备
<ol>
 <li>人角质形成细胞（FEP-1811）在添加了表皮生长因子、牛垂体提取物和 20 μg/ml 庆大霉素的无血清角质形成细胞培养基（K-SFM；Invitrogen）中培养，培养条件为 37°C 和 5% CO2。</li>
 <li>使用胰蛋白酶-EDTA（0.05% v/v）消化获得单细胞悬液。</li>
 <li>将细胞以每孔 10,000 个细胞的密度接种于 8 孔 Lab Tek II 培养腔载玻片中，并在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 3 天。</li>
</ol>
辐照
<ol>
 <li>使用 137Cs 源（Gammacell 1000 Elite 照射装置；Nordion International, ON, Canada；20.6 秒/Gy）在冰上对细胞进行 2 Gy 剂量的照射</li>
 <li>未照射的对照组细胞和接受 2 Gy 照射的细胞在 37°C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。</li>
</ol>
免疫荧光染色
<ol>
 <li>将培养基弃去，每孔加入 300 μL 磷酸盐缓冲液（PBS，不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞，并在旋转混合仪上孵育 5 分钟。</li>
 <li>弃去缓冲液，每孔加入 100 μL 新鲜配制的 4%（v/v）多聚甲醛，将载玻片在室温下孵育 10 分钟。 所有孵育步骤均在加湿的染色槽中进行</li>
 <li>随后用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞。将载玻片放入 Coplin 染色缸中，在旋转混合仪上孵育 5 分钟。此洗涤步骤重复进行两次。</li>
 <li>弃去缓冲液，并用吸水纸轻轻吸除多余的 PBS。</li>
 <li>每孔加入 100 μL 0.1%（v/v）Triton X-100 进行细胞通透处理，在室温下孵育 10 分钟。</li>
 <li>按照上述第 3 和第 4 步所述方法，用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞。</li>
 <li>每孔加入 100 μL BSA（1% v/v）封闭非特异性蛋白结合位点，在室温下孵育 20 分钟。</li>
 <li>弃去多余的 BSA，每孔加入 100 μL 小鼠单克隆抗磷酸化组蛋白-H2AX 一抗（用 1% BSA 按 1:500 稀释；Millipore），在室温下孵育 1 小时。</li>
 <li>按照上述第 3 和第 4 步所述方法，用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞，然后每孔加入 100 μL 二抗（Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG，用 1% BSA 按 1:500 稀释；Invitrogen），在避光条件下室温孵育 45 分钟。（稀释后的抗体在整个操作过程中均需避光保存）</li>
 <li>按照上述第 10 步所述方法，用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞。操作过程中使用铝箔尽量减少光照。</li>
 <li>每孔加入 100 μL TOPRO-3（按 1:500 稀释；Invitrogen）进行细胞核复染，在室温下孵育 10 分钟。</li>
 <li>按照上述第 10 步所述方法，用 PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）洗涤细胞。</li>
 <li>小心从载玻片上移除腔室，吸除多余液体，让载玻片自然风干。</li>
 <li>每孔滴加一滴 ProLong GOLD 抗荧光淬灭封片剂（Invitrogen），加盖盖玻片（22×50 mm）封片，并吸除载玻片边缘多余的液体。</li>
 <li>将载玻片在室温下避光放置 30 分钟后，用指甲油密封。</li>
 <li>分析前将载玻片在 4°C 避光条件下过夜保存。</li>
</ol>
显微镜 / 分析
<ol>
 <li>使用 Zeiss LSM510 Meta 共聚焦显微镜，通过标准 GFP 激光（用于 γH2AX - Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG）和远红激光（用于 TOPRO-3）采集图像。通常使用 63 倍油镜物镜。 以 0.5 μm 的步长进行 Z 轴序列成像。选择 0.5 μm 的步长以最大程度减少存在于细胞核不同焦平面的焦点丢失。在分析过程中，对各个焦平面图像进行去卷积并叠加，生成最大投影图像，以减少焦点重叠（应用 Top-hat 滤波器）。</li>
 <li>使用 Metamorph（Molecular Devices，美国）分析焦点数量。 该程序在设定阈值以排除背景后，对每个细胞中的焦点数量进行定量。相关数据记录于 Microsoft Excel 电子表格中，用于进一步分析。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="细胞DNA损伤分析；γH2AX染色荧光显微镜图像；未处理组与2 Gy照射组对比。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 图1. 未处理的人角质形成细胞及经2 Gy辐射后在37°C、5% CO2条件下继续培养1小时的细胞中γH2AX焦点（绿色）的免疫荧光可视化图像。DNA用TOPRO-3（蓝色）染色。图像使用Zeiss LSM 510 Meta共聚焦显微镜采集。标尺 = 10 μm。
<img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="荧光显微镜，γH2AX，TOPRO-3染色，细胞核，DNA损伤，合并图像分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 图2. 人角质形成细胞经2 Gy辐照并在37°C、5% CO2条件下继续孵育1小时后，γH2AX焦点（绿色）的免疫荧光可视化图像。使用蔡司LSM 510 Meta共聚焦显微镜以0.5 μm Z轴层厚（1-9）采集图像，以确保获取所有焦点信号。随后使用Metamorph软件对图像进行叠加以进行定量分析。DNA用TOPRO-3（蓝色）染色。叠加后的γH2AX图像与蓝色通道图像合并以供观察。比例尺 = 10 μm。

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

暴露于电离辐射（γ射线）后，γH2AX 焦点迅速形成，并在30-60分钟内达到峰值2。因此，我们选择照射后1小时的时间点以反映初始DNA双链断裂（DSB）的形成。本实验采用了临床上相关的2 Gy辐射剂量。然而，该方法可用于检测最高达4 Gy辐射剂量下的初始DSB形成；更高剂量下焦点出现显著重叠，导致无法准确量化。对于更长的照射后孵育时间，可使用更高的辐射剂量，因为随着DNA修复的进行，γH2AX焦点会逐渐消失，从而获得可量化的焦点数量。通常，照射后4小时至24小时的孵育时间被用于监测DNA修复过程。由于共聚焦显微镜激发激光的限制，我们采用了DNA染料TOPRO-3。更常用的核复染试剂是4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）。尽管我们使用了共聚焦显微镜，但具备z轴层扫功能的落射荧光显微镜也足以满足检测需求。该免疫荧光方法适用于其他贴壁生长的癌细胞和正常细胞系；我们已测试过T98G人胶质母细胞瘤细胞、正常人血管内皮细胞以及大鼠H9c2胚胎心室肌细胞。
最后，γH2AX的定量在电离辐射诱导的DNA损伤研究中具有重要价值，可用于监测DNA损伤（如本实验所示...

<table><tbody><tr><td>角质形成细胞无血清培养基（K-SFM）</td><td>培养基</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>添加了人重组表皮生长因子1-53（EGF 1-53）和牛垂体提取物（BPE）的角质形成细胞培养基。</td></tr><tr><td>Lab Tek II 培养腔载玻片（8孔）</td><td>培养腔载玻片</td><td>Nalge Nunc International</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（22×50 mm）</td><td>盖玻片</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>使用1% BSA封闭非特异性抗体结合位点。一抗和二抗均用1% BSA稀释。</td></tr><tr><td>PBS（不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;和Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA ×10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>使用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养瓶中消化下来。</td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>使用0.1%曲拉通X-100对细胞进行透化处理。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>使用4%多聚甲醛固定细胞。</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗磷酸化组蛋白H2AX抗体</td><td>一抗</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>一抗稀释比例为1:500，溶于1% BSA中。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>二抗</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>二抗稀释比例为1:500，溶于1% BSA中。</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA染料</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>常用的DNA染料：4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）。仅可用于配备合适激发激光的显微镜。</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>在20&amp;#x00B0;C时折射率为1.42。</td></tr><tr><td>组织培养瓶，带透气盖</td><td>培养瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿（150×25 mm）</td><td>培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>玻璃染色缸（Coplin Jar）</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>染色槽</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite 放射源</td><td>γ射线辐照仪</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta 共聚焦显微镜</td><td>共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>图像分析软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

电离辐射后γh2ax焦点的定量分析

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA双链断裂（DSBs）由内源性代谢过程或外源性因素引起，是与细胞存活和基因组完整性维持密切相关的一类最为严重的DNA损伤。DSBs发生后早期反应之一是在高度保守的C末端SQEY基序中的丝氨酸-139位点对组蛋白变体H2AX进行磷酸化，从而形成γH2AX。1. 在DNA双链断裂（DSBs）发生后，H2AX会迅速被磷脂酰肌醇3-激酶（PIKK）家族蛋白——即共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）、DNA-蛋白激酶催化亚基以及ATM和RAD3相关蛋白（ATR）——所磷酸化。2通常只有少数几个碱基对（bp）参与双链断裂（DSB），但由于染色质修饰在DNA损伤信号传导和修复中的重要作用，信号会被显著放大。主要由ATM介导的H2AX磷酸化会扩散到邻近的染色质区域，每个DSB可影响约0.03%的细胞总H2AX。2,3. 这相当于在 DSB 位点周围约 2 Mbp 的染色质区域中，大约 2000 个 H2AX 分子发生磷酸化，从而形成离散的 γH2AX 焦点，可通过免疫荧光显微镜轻松观察和定量。2DSB处γH2AX的消失反映了损伤修复，然而关于DSB完全修复的定义仍存在争议；有观点认为DNA双链的重新连接已足以代表修复完成，但也有研究提出，染色质压缩状态的原始结构恢复是必要的。4-8. γH2AX 的消失至少部分涉及蛋白磷酸酶 2A 和蛋白磷酸酶 4C 介导的去磷酸化作用5,6. 此外，通过涉及H2A.Z与组蛋白交换的重新分布机制去除γH2AX也已被证实7,8. 重要的是，对γH2AX焦点的定量分析已在医学和核科学研究中得到广泛应用。在此，我们展示了最常用的免疫荧光方法，用于通过检测和定量γ射线照射后贴壁的人类角质形成细胞中的γH2AX焦点，以评估初始DNA损伤9.

利用γH2AX形成作为分子标志物来定量DNA双链断裂，已成为辐射生物学中不可或缺的工具。本文展示了使用免疫荧光法对细胞经辐射暴露后γH2AX焦点进行定量分析的方法。

电离辐射后γH2AX焦点的定量分析

DNA双链断裂（DSBs）可由内源性代谢过程或外源性因素诱导产生，是最严重的DNA损伤类型之一……

大家好，我是来自贝克尔眼科、DI心脏与糖尿病研究所 Caris 博士领导的表观基因组医学实验室的 Ian Ma。我目前正在攻读博士学位，主要研究重点是辐射对γ-H2A.X的影响，γ-H2A.X是DNA双链断裂的分子标志物。今天我将演示一项实验，用于定量分析人源成纤维细胞在γ射线辐射后γ-H2A.X的表达变化。该免疫染色方案可用于同时检测初始的DNA损伤以及DNA修复过程。该方法还可用于评估潜在辐射修饰化合物的效果。例如，放射增敏剂预期会增加DNA损伤，从而导致检测到更多的γH2AX焦点；而放射保护剂则具有相反的作用，由于DNA双链断裂减少，所检测到的γH2AX焦点数量也会降低。现在开始实验。本实验所用细胞为人源细胞，已接种于腔室载玻片中，每孔含10,000个细胞。载玻片在辐射处理前需在37°C、5%二氧化碳条件下孵育三天。将转运器2D辐照仪置于冰上切片，随后在2 Gy剂量下进行辐照，同时保留未辐照的对照组玻片。辐照后，将玻片放回培养箱中孵育1小时，此孵育阶段使我们能够观察初始的DNA损伤。接下来进行染色。首先在孔板中小心制备小室，然后向其中加入 300 µL 不含氯化钙和氯化镁的 PBS。为清洗细胞，将孔板置于板式摇床上震荡 5 分钟，随后轻轻倒出 PBS。接着，加入 100 µL 4% 多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育 10 分钟，之后将孔板转移至装有 PBS 的密封罐中，继续在板式摇床上震荡 5 分钟。此洗涤步骤重复进行，共完成三次，每次五分钟。洗涤后，将载玻片在吸水纸上轻轻干燥。为去除多余的PBS，随后在室温下用100微升0.1%Try处理细胞10分钟。10分钟后，按照前述方法，将载玻片用PBS洗涤三次，每次五分钟。随后，向该孔中加入100 µL的1% BSA，室温孵育20分钟，以阻断非特异性结合。阻断步骤完成后，弃去BSA溶液，每孔加入100 µL一抗溶液，该溶液由抗磷酸化γH2X抗体按1:500比例稀释而成。将载玻片在室温下放置一小时，随后用 PBS 洗涤三次，每次五分钟。甩去多余的 PBS，每孔加入 100 µL 二抗，该二抗为 Alexa Fluor 488 金标抗小鼠 IgG，按 1:500 稀释，加入后避光孵育 45 分钟，室温孵育。孵育结束后，将载玻片用 PBS 洗涤三次，每次五分钟，并用铝箔包裹以防止光漂白。加入 100 µL 核染色剂。将上排的三个加入到孔中孵育10分钟，随后用PBS洗涤两次，每次5分钟。洗涤后，小室现在可以从小玻片上取下。轻轻向上拉动小室并将其取下，然后将玻片从 holder 中取出。轻敲去除多余的水分，让载玻片干燥后再滴加一滴Prolong Gold抗荧光淬灭试剂。缓慢将盖玻片盖在载玻片上，注意避免产生气泡。擦去多余的试剂，将样本在室温避光条件下静置半小时。最后，沿盖玻片边缘涂抹指甲油以固定，并将载玻片置于4°C避光

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

电离辐射的反应定量的γH2AX灶

基于γH2AX焦点对DNA双链断裂进行定量已成为一种不可或缺的工具，尤其在辐射生物学中，可用于评估组织的放射敏感性以及辐射修饰化合物的作用效果。本文展示了在组织样本中利用免疫荧光法对γH2AX焦点进行定量的方法。...

组织样本中γH2AX焦点的定量分析

在DNA双链断裂后，H2AX在Ser-139位点发生磷酸化，形成γH2AX焦点，其显微分析已成为辐射生物学中不可或缺的工具。本文中，我们采用针对赖氨酸4位单甲基化组蛋白H3的抗体作为活跃转录的常染色质的表观遗传标记，以评估辐射诱导的γH2AX在细胞核内的空间分布。...

电离辐射后γH2AX空间分布的评估

一种用于评估慢性因素可能诱导的DNA损伤水平及DNA修复能力变化的实验方案 体内 通过流式细胞术检测磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂的标志物），展示小鼠脾淋巴细胞中低剂量辐射的影响。...

测量慢性处理后小鼠脾细胞中的DNA损伤与修复 体内 暴露于极低剂量的β射线和γ射线

本文提供了一种通过γH2AX和53BP1的免疫荧光显微镜分析DNA双链断裂的实验方案。...

γH2AX与53BP1免疫荧光显微镜检测用于分析DNA双链断裂的形成与修复

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

该方法结合了DNA双链断裂（DSBs）的定量分析、细胞周期分布和细胞凋亡检测，能够实现针对细胞周期特异性的DSB诱导与修复评估，以及修复失败所导致后果的分析。...

细胞周期特异性检测基因毒性应激后γH2AX与细胞凋亡的流式细胞术方法

中子混合束在硼中子俘获治疗（BNCT）中的应用所引发的辐射诱导DNA损伤应答尚未完全阐明。本方案提供了一步一步的操作流程，用于在中子混合束辐照后，通过免疫荧光染色法检测人结肠癌细胞系中DNA修复蛋白的辐射诱导焦点（RIF）。...

人结肠癌细胞中DNA损伤与修复灶的免疫荧光成像

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本方案介绍了外周血淋巴细胞中γ-H2AX焦点检测的载玻片制备及自动化计数方法。为展示该检测方法及其灵敏度，分离后的淋巴ocytes接受了辐照处理...

一种用于人外周血淋巴细胞γ-H2AX焦点检测的自动化显微评分方法

本方案介绍了一种通过同时检测博来霉素处理的人外周血淋巴细胞间期细胞核中γH2AX和53BP1焦点，以评估DNA双链断裂形成与修复的方法。...

人外周淋巴细胞中γH2AX与53BP1的双重免疫荧光染色

本文介绍一种在DNA损伤位点检测蛋白质相互作用的简单快速方案。...

邻近连接测定法定位DNA损伤位点中的蛋白质

学习利用免疫荧光技术定量检测γH2AX灶，评估电离辐射诱导的人细胞DNA双链断裂损伤。该方法可监测初始DNA损伤及修复过程，适用于放射增敏剂和防护剂的效果评价。

电离辐射后γH2AX焦点的定量分析

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