電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

こんにちは、Baker Eye, DI Heart and Diabetes InstituteのEpigenomic Medicine LabのTom Caris博士が所長を務めるIan Maです。私は現在、博士号を取得しており、二本鎖切断の分子マーカーであるGamma H two A Xに対する放射線の影響に重点を置いています。今日は、ヒトのクレタ島におけるガンマ線に対するGamma H two A expoの定量に関する実験を実演します。

この免疫染色プロトコルは、初期DNA損傷とDNA修復の両方をモニターするために使用できます。この方法は、潜在的な放射線修飾化合物の有効性を評価するのにも役立ちます。例えば、DNA損傷を増加させることが予想される電波増感剤は、ガンマH 2 A X 4面の数が多くなりますが、ラジカルプロテクターは逆の効果があり、DNA二本鎖三つ編みが減少するため、ForSightの検出数が少なくなります。

それでは、実験を始めましょう。実験。この実験で使用される細胞はヒト細胞であり、各ウェルに10, 000個の細胞が座っているチャンバースライドで調製されます。スライドは、放射線照射前に3日間、5%二酸化炭素中で37度でインキュベートされます。

トランスポーターを氷上で2D照射器でスライスし、次に2つの灰色で照射し、制御されたスライドは照射しないままにします。照射スライドをインキュベーターに1時間戻した後、このインキュベーション期間により、初期のDNA損傷を観察することができます。次は染色です。

媒体はカルシウムの塩化物およびマグネシウムの塩化物の自由なPBSの300マイクロリットルをそれ部屋に加える前に井戸を慎重に造ること最初にである。細胞をすすぐには、PBSをやさしく傾ける前に、プレートシェーカーで左側を5分間スライスします。次に、細胞を100マイクロリットルの4%パラアルデヒドに固定し、室温で10分間放置した後、PBSを充填したコトンジャーにプレートシェーカーで5分間入れます。

この洗浄ステップを繰り返して、合計3回の5分間の洗浄を行います。洗浄後、スライドは吸収紙でやさしく乾燥されます。余分なPBSを除去するために、細胞は、次いで、0.1%の百マイクロリットルでプレミアム化されます 室温で10分間次の100を試してください 10分後、スライドをPB Sで3回、前に示したように5分間それぞれ洗浄します。

次に、100マイクロリットルの1%BSAをこれに加え、非特異的結合をブロックするために20分間放置した。ブロッキングステップの後、BSAを振り落とし、500分の1の希釈抗リン酸化からなる一次抗体100マイクロリットルを振り落とします。Gamma H two X抗体を各ウェルに添加します。

スライドを室温で1時間放置した後、PBSで5分間を3回洗浄します。過剰なPBSを振り落とし、Alexaフロア4 88金抗マウスIgGの500分の1希釈からなる二次抗体の100マイクロリットルを添加し、インキュベーションスライドの最後に室温で45分間暗所でインキュベートするために放置し、PB S3で5回洗浄し、それぞれホイルで覆って光漂白を防ぎます。100マイクロリットルの核の汚れ。

一番上の3行目を10分間ウェルに加え、続いて5分間の洗浄を2回行います。PBSを使用すると、チャンバーをスライドから取り外す準備が整いました。チャンバーを上に引っ張ってそっと取り外し、スライドをホルダーから外します。

余分な水分を取り除き、スライドを乾かしてから、長期の金Antifa試薬を一滴加えます。気泡が溜まらないように注意しながら、カバースリップをスライド上にゆっくりと下げます。アクセス試薬を拭き取り、スライスを室温で30分間暗所に放置します。

最後に、カバースリップの側面に沿ってマニキュアを塗って固定し、スライドを4度で暗闇に一晩放置します。共焦点顕微鏡を使用して、形成されたγ H 2 Aの博覧会会場を視覚化します。背景ノイズを最小限に抑えたシャープな画像が得られるように設定を調整します。

Zシリーズパターンでは、原子核の異なる平面に存在する病巣の損失を最小限に抑えるために、0.5ミクロンのステップサイズの画像が必要です。解析中、個々の平面は畳み込まれて積み重ねられ、焦点のオーバーラップを最小限に抑えるために最大の投影画像が生成されます。生成された病巣の数を定量化するために、プログラムのメタが使用され、各核はプログラム上で利用可能なツールを使用して強調表示され、関心の各領域はガンマH 2 A X病巣を有する画像上に転写され得る。

プログラムは、しきい値が適用されてすべてのバックグラウンドが除外された後、各セル内の多数の焦点を定量化し、情報はさらに分析するためにExcelスプレッドシートにロックされます。これで、炭素放射線への曝露後の初期D損傷を視覚化するための免疫設定プロトコルは終了です。この高感度アッセイは、高い再現性と信頼性で、二本鎖ブレーキが関与する放射線誘発性損傷の他の側面にも適用できます。

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