Name: 在Live主机转利什曼原虫寄生虫在体内成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 了解活体利什曼原虫感染成像技术，通过IVIS系统对小鼠进行非侵入式生物发光成像。该方法可定量检测荧光素酶表达寄生虫，为研究慢性感染动态提供重要工具。

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本工作部分由美国退伍军人事务部的优异评审资助项目、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI045540、AI067874、AI076233-01 和 AI080801（MEW）以及 AI29646（SMB）资助完成。部分工作是在 CT 和 JG 获 NIH T32 AI07511 项目资助期间完成的。

1. 转基因小型动物的感染 利什曼原虫
1. 寄生虫品系
转基因 利什曼原虫 使用附加体或整合型载体，按照已有报道的方法，构建表达荧光素酶的 spp. 寄生虫。1 2 克隆细胞系为首选。两个重要要点是：
（a）与附加体质粒表达的荧光素酶相比，整合型荧光素酶更受青睐，因为理论上这些寄生虫品系在无药物压力条件下（即导入哺乳动物体内后）应能更稳定地保留外源转基因。然而，即使整合型转基因也可能以较低频率发生丢失。3 因此，对保藏培养物维持选择性药物压力至关重要。在实际操作中， 利什曼原虫 spp. 通常即使在长时间内也能保留附加体元件 体内，尽管每个细胞中的质粒拷贝数存在差异。4 对于任一类型的转基因寄生虫，在接种到动物体内之前，都应先在体外传代一次，以避免潜在的药物影响。
(b) 该 利什曼原虫 spp. 寄生虫在体外培养过程中可能会丧失毒力。在某些物种中（例如 L. donovani，L. infantum chagasi）这种损失可能在数周的培养过程中迅速发生。在其他物种（例如， L. major, L. mexicana毒力可长期保持，持续数月到数年。然而，仍应对克隆转染子进行筛选，以鉴定那些对小型动物保持完全毒力的株系。许多实验室在实验使用前，会将寄生虫连续通过小鼠或仓鼠传代数次（4次或以上），以增强其毒力。
2. 制备用于感染的感染性前鞭毛体阶段寄生虫
由白蛉传播给哺乳动物宿主的Leishmania spp. 感染性形式为前鞭毛体的前循环型（metacyclic promastigote）5。因此，使用该形态的寄生虫进行动物感染，更适合作为自然感染的模型。尽管白蛉难以维持培养，但在体外培养的寄生虫可方便地完成前循环型转化（metacyclogenesis）。培养物中前循环型所占比例会因自动物分离后的传代次数、培养基种类以及寄生虫的物种和菌株不同而有所差异。
根据物种和品系的不同，可以通过阳性或阴性筛选纯化后循环体 利什曼原虫. 富含于表面的脂磷糖苷（LPG）的末端或侧链碳水化合物残基的变化 L. major 通过花生凝集素（PNA）凝集反应的消失，使其得以纯化。5,6 其他 利什曼原虫 物种或 L. major 缺乏前循环LPG的突变体可通过Ficoll梯度离心纯化。7 IVIS 可使用未经纯化的大量培养物进行，但需注意这些培养物含有混合形态，包括感染性较强的前鞭毛体和感染性较弱的其他形式。
通常，使用从仓鼠或小鼠体内分离后3周内获得的利什曼原虫（L. i. chagasi）进行培养，可从大量静止期培养物中回收15–20%的前鞭毛体。将寄生虫通过离心洗涤后，重悬于所需浓度的缓冲液（HBSS或PBS，含或不含Ca2+和Mg2+）中，并在接种至小鼠前于4°C保存不超过2小时。
3. 将利什曼原虫（Leishmania spp.）接种至宿主的途径选择
人类利什曼病的临床疾病表现取决于寄生虫种类和宿主因素。小鼠感染也存在相应差异，导致研究人员采用不同的模型和感染途径。例如，引起人类皮肤利什曼病（CL）的物种（如L. major, L. mexicana, L. amazonensis）通常通过皮下接种于小鼠足垫，或皮内注射于耳部。8,9 引起人类内脏利什曼病（VL）的物种则常通过尾静脉静脉注射10-12，或皮内注射于耳部。13 尾静脉感染可使用仓鼠来源的无鞭毛体或前鞭毛体进行。我们通常使用L. i. chagasi前鞭毛体感染小鼠，注射方式为耳部或外侧跗部皮内注射14，或静脉注射。
4. 用麻醉剂对小鼠进行预处理
可使用野生型、转基因或基因敲除小鼠。尽管尚未经过正式量化，但似乎无胸腺裸鼠或白化小鼠（如BALB/c小鼠）的组织透光性较皮肤和毛发色素较深的小鼠（如C57BL/6小鼠）更佳。
注射用麻醉剂是一种优选方法，例如将氯胺酮与赛拉嗪混合物（分别为80-100 mg/kg和10 mg/kg，腹腔内注射（i.p.））用生理盐水稀释后使用，单次给药即可使动物轻度麻醉至少10分钟。使用25-30号针头，腹腔注射总体积为100-200 µl。操作时用手牢固地夹住动物背部皮肤，使其腹部朝上、头部朝下。针头应斜面向上并略微倾斜，针尖仅需轻微刺入腹壁的左下象限即可。
可选择使用吸入性麻醉剂（如异氟烷），但动物仅在吸入麻醉剂期间保持麻醉状态。
5. 用利什曼原虫（Leishmania spp.）感染小鼠
动物经轻度麻醉后，使用70%乙醇或异丙醇清洁感染部位。寄生虫种类、接种剂量及感染途径由研究人员确定。皮内注射（10 μl）或肌内注射（25–50 μl）时，注射体积应尽量减小，以避免造成过度的组织损伤。小鼠静脉注射（100–200 μl）、皮下注射（可达2 ml）或腹腔注射（可达2 ml）的允许注射体积可更大。
本实验中使用的感染途径和体积包括耳廓皮内注射（10 μl）、侧腹皮下注射（100–200 μl）、腹腔内注射（100–200 μl）或静脉内注射（100–200 μl）。寄生虫接种剂量范围为 102 至 107 个前鞭毛体。
2. 生物发光成像 利什曼原虫 使用 IVIS（体内 成像系统
1. 体内生物发光成像用D-荧光素的制备
D-荧光素（Caliper LifeSciences）用 Dulbecco's PBS 重悬，终浓度为 15 mg/ml，可含或不含 Mg2+ 和 Ca2+，并用注射器滤器（0.2 μm）过滤。分装后于 -80°C 冻存，直至使用。注射前，将荧光素在 37°C 水浴中温育至溶解。
2. 注射D-荧光素酶底物
注射部位经清洁后，通过腹腔注射将浓度为15 mg/ml的荧光素溶液（溶于DPBS）以150 mg/kg的剂量注入清醒状态的动物体内。荧光素也可注射至麻醉处理的动物，但生物发光动力学可能略有差异。
注射入动物体内后，荧光素会迅速循环分布。由于荧光素分布的动力学可能有所不同，因此针对每种实验模型以及小鼠不同的解剖部位，通过实验确定注射荧光素后获取生物发光数据的最佳时间非常有用。通过连续采集多张重复图像，可生成一条动力学曲线。
3. 动物被轻度麻醉
成像过程可使用吸入性或注射性麻醉剂。此阶段使用异氟烷更为简便，因为大多数IVIS系统均配备有与成像室相连的麻醉舱以及位于成像室内麻醉鼻罩多通管。麻醉气体通过麻醉舱和成像室内的多通管进行分流。
将动物放入透明的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）麻醉室中，使用2.5–3.5%异氟烷进行轻度麻醉。通过肉眼观察动物状态，确保已达到有效的麻醉深度，并且呼吸未受阻碍。通过施加足垫疼痛刺激后无回缩反应来确认麻醉程度足够。动物达到轻度麻醉后，可将异氟烷浓度降低至1.5–2%。
4. 收集生物发光数据
将充分麻醉的动物从麻醉舱转移至成像舱，并调整位置，使连接在歧管上的鼻罩能够持续且稳定地输送异氟烷。
启动活体成像软件程序（Caliper Life Sciences）并初始化IVIS系统。在我们的实验中，使用的是Xenogen IVIS 200系统（Caliper Life Sciences）。初始化IVIS后，CCD相机将自动冷却并维持在适当的工作温度。相机系统的设置和图像采集参数在IVIS系统控制面板中进行设定。采集参数主要取决于动物数量和生物发光强度。重要参数包括：成像模式（生物发光或荧光）、曝光时间（快门开启时间）、 binning（决定CCD上的像素大小）、聚焦和样本高度（焦平面）、f/stop（光圈大小）以及视野（FOV）。IVIS成像系统200系列的预设视野（方形图像区域）为4、6.5、13、20和25 cm（视野宽度）。
在IVIS系统控制窗口中点击“采集”或“连续采集图像”即可启动IVIS的图像和数据采集。采集时间可从几秒到数分钟不等。在我们的实验中，采用60秒的默认曝光设置。
近距离成像（小视野）可能提供更高的分辨率，但与使用较大视野拍摄的图像相比，其灵敏度不一定更高。
成像过程结束后，将动物从成像舱中取出，放回笼中，并监测其直至从麻醉中恢复。 
7. 数据分析
使用 Living Image 软件（Xenogen）分析发光数据，该数据对应于 CCD 相机检测到的光子数量所表示的光强度。这些数据以伪彩色图像的形式呈现，并叠加在动物的黑白照片上。可通过创建感兴趣区域（ROI）来分析图像的特定部分。Living Image 软件提供了多种数据输出选项。分析数据的最简单方法之一是选择一个感兴趣区域（ROI），并测量检测到的平均光子数/秒。随后可将这些数据导出至 Microsoft Office Excel（Microsoft Corporation）等电子表格软件中。本稿件中的图表使用 GraphPad Prism（GraphPad Software）生成。
3. 代表性结果
摘要：
IVIS 技术能够实时可视化活体麻醉 BALB/c 小鼠体内表达荧光素酶的Leishmania spp. 寄生虫。当底物荧光素在组织中分布后，转基因寄生虫所表达的荧光素酶会迅速氧化 D-荧光素，从而产生光信号。未被组织吸收的光子将由 IVIS 成像技术的 CCD 相机在动物体表检测到。
1. 引起人类内脏利什曼病与人类皮肤利什曼病的寄生虫感染模型。
内脏利什曼病的小鼠模型比皮肤利什曼病模型更具挑战性，因为检测感染进程需要在每个时间点处死成组的小鼠。IVIS技术的一个局限性在于，不同内脏组织对光信号的淬灭程度不同，血流丰富的组织（如肝脏和脾脏）可能比皮肤更成问题。因此，IVIS在检测肝脏和脾脏中表达荧光素酶的寄生虫时，其灵敏度可能不如在皮肤中。此外，不建议在不同组织部位之间比较寄生虫负荷。尽管如此，同品系、同龄感染小鼠之间相同组织中的寄生虫负荷仍可进行比较。
荧光素酶信号在我们的实验中可轻易在内脏器官中检测到，便于动物间感染情况的比较。图1展示了表达荧光素酶、引起人类内脏利什曼病的利什曼原虫（L.i. chagasi SSU/IR1SAT-LUC(A)）感染5周后的示例。感染5周后，所有小鼠的肝脏以及小鼠1和2的脾脏中均可检测到内脏化寄生虫。图2显示了相同寄生虫株在接种后一小时的剂量滴定结果。图3展示了引起人类皮肤利什曼病的寄生虫进行长期感染的示例， L. mexicana SSU/IR1SAT-LUC(A) 如图3所示。
2. 荧光素酶检测的动力学。
初步的动力学研究对于最大限度地检测发光寄生虫所发射的光子至关重要。必须通过实验确定最佳成像时间，因为该时间可能因寄生虫分离株的数量和发光强度以及发光微生物在小鼠体内的解剖位置不同而有所差异。动力学研究结果取决于荧光素在组织中的分布速率、携带表达荧光素酶的利什曼原虫的小鼠组织，以及每种寄生虫分离株中荧光素酶表达水平/酶活性的效率。按照前述方法感染小鼠并接种荧光素后，自注射荧光素起每2分钟采集一次图像序列。对发射光强度进行定量并绘制成图，以确定信号检测的最大值（见图1B示例）。一旦确定了光信号检测的峰值时间，实验中所有图像均应在接种荧光素后相同的时间点进行成像，如图1A所示。 
我们的动力学研究表明，经静脉感染L. i. chagasi的小鼠在腹腔接种荧光素后10至25分钟期间，肝脏部位的荧光素酶信号达到峰值（图1B）。
3. 评估寄生虫接种效率。
IVIS 可用于评估表达荧光素酶的利什曼原虫（Leishmania spp.）初始感染的一致性和效率。只要每只动物采用相同的接种途径，所发射的光子数即可作为接种效果的粗略估计。图2展示了一个示例，其中 BALB/c 小鼠接种了指定数量的利什曼原虫（L. i. chagasi）前鞭毛体，该物种可引起内脏利什曼病。感染后1小时，小鼠经腹腔注射荧光素，20分钟后采集图像。该图显示了单独的黑白图像（图2A）以及叠加伪彩色发光信号的图像（图2B）。图2C展示了从小鼠图像中选定感兴趣区域（ROI）发射出的光子数量。
图2中的示例表明，感染剂量与寄生虫数量增加时发射的光子梯度呈正比。L. major 和 L. mexicana 与之类似，利用Leishmania spp.进行皮肤感染成像具有很高的灵敏度，能够清晰地观察到少于104个的寄生虫。此类数据可用于量化感染强度。在图2B所示的示例中，每个寄生虫大约产生1个光子/秒。
4. 监测小鼠感染过程。
皮肤利什曼病的小鼠模型通常以病损大小作为纵向追踪感染进程的指标。尽管病损大小能够较好地反映疾病进展，但其不仅受组织中寄生虫复制速率的影响，还受到炎症反应程度的影响。要实际测定寄生虫负荷，必须在实验结束时处死小鼠。IVIS 可用于纵向估算感染引起皮肤利什曼病的Leishmania物种的小鼠皮肤组织中的寄生虫负荷。如图3所示，BALB/c小鼠在第0天皮下接种表达荧光素酶的105个L. mexicana，并在感染后的连续数周内进行成像。图3A展示了感染后10至31周的代表性图像，相同数据以定量形式显示在图3B中。重要的是，在其他方法尚无法检测到病损时，即可通过IVIS对感染部位的寄生虫数量进行定量。
随着时间推移，生物发光信号的逐步增强对应于寄生虫数量的增加。信号强度（即光子/寄生虫/秒）可能因寄生虫数量、组织位置、生长阶段以及体内寄生虫的健康状况而变化。因此，在假设生物发光强度与寄生虫数量成正比之前，必须先校准寄生虫数量与发光信号之间的关系。对于L. major15或L. mexicana16而言，足垫病灶内无鞭毛体的生物发光衰减程度相对于前鞭毛体而言相对较小。初步数据显示，L. chagasi infantum17或L. braziliensis15的发光衰减可能更为显著。
<img src="/files/ftp_upload/1980/1980fig1.jpg" alt="生物发光成像、发光检测数据、示意图、小鼠感染研究，标记感兴趣区域。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 荧光素酶检测的动力学分析。 通过分析荧光素的动力学分布，确定在肝脏中成像Leishmania感染的最佳时间点。小鼠通过尾静脉注射感染107个L. i. chagasi pIR1SAT-LUC(A)。A) 感染5周后，对4只感染小鼠和1只未感染小鼠进行成像。所有5只小鼠均腹腔注射荧光素，随后每2分钟采集一次图像，持续24分钟。选定感兴趣区域（ROI），并对发光信号进行测量与定量分析（B）。
<img src="/files/ftp_upload/1980/1980fig2.jpg" alt="生物发光成像；小鼠中寄生虫剂量反应；发光强度定量；实验结果" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 评估寄生虫接种效率。 使用 IVIS 对感染过程中表达生物发光的 Leishmania 寄生虫进行成像与定量。将野生型 BALB/c 小鼠在右下侧腹部皮内注射 HBSS（模拟感染）或转基因 Leishmania i. chagasi L. i. chagasi pIR1SAT-LUC(A)。接种后一小时，使用 IVIS 成像技术对小鼠进行分析。A) 在测量发光信号（光强度）前立即拍摄小鼠的黑白照片，红色箭头指示每只动物的注射部位。B) 将伪彩色发光图像叠加在照片上。C) 选择感兴趣区域（ROI，红色圆圈），并对每个 ROI 中的发光强度进行定量。数据表示感染 ROI 的净发光强度减去模拟感染 ROI 的发光强度。
<img src="/files/ftp_upload/1980/1980fig3.jpg" alt="小鼠生物发光成像进展，包含强度标尺和生长数据图表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 导致人类皮肤利什曼病的寄生虫长期感染情况。 对单只注射了生物发光标记的Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC(A) 的动物体内寄生虫负荷进行时间进程评估。一只野生型BALB/c小鼠在踝关节处皮下接种100,000个静止期转基因Leishmania mexicana pIR1SAT-LUC(A)。在感染后的指定周数采集感染小鼠的IVIS数据。A) 将伪彩色发光图像叠加到相应时间点的黑白照片上。B) 通过测量感染踝关节的发光强度，并减去对侧未感染踝关节的背景ROI，得到净ROI并绘制成图。散点图表示感染后不同时间点的净ROI值。

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<li>Lecoeur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Topical+Therapy+for+Leishmania+major+Localized+Cutaneous+Leishmaniasis+Using+a+Reliable+C57BL%2F6+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model.</a> PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).</li>
<li>Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Leishmania+development+in+their+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Imaging Leishmania development in their host cells.</a> Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

的 体内 成像系统（IVIS）提供了一种用于整体动物成像的方法或 体内 成像不同形式的利什曼病实验感染模型。18,16 这 利什曼原虫 spp. 寄生虫可被改造以表达萤火虫荧光素酶，其表达水平可被检测到 体内 利用IVIS成像技术。该方法的主要优势之一在于能够实现无创可视化 利什曼原虫 spp. 在活体动物宿主内的分布。该方法已应用于其他可表达外源基因的病原体感染疾病模型。19 20 此外，IVIS 已被用作评估药物治疗的模型 Leishmania major C57BL/6小鼠皮肤感染。16,21
该方法存在一些重要的注意事项和局限性。CCD相机检测到的光信号强度可能受到寄生虫在哺乳动物宿主体内位置、寄生虫中荧光素酶表达水平、D-荧光素氧化反应所需辅因子的可利用性以及覆盖组织对光的吸收等因素的影响。此外，肝脏和脾脏中的信号强度（以每秒每寄生虫发射的光子数计）弱于皮肤中的信号，这可能是由于局部血液供应和覆盖组...

<table><tbody><tr><td>D-Luciferin 钾盐</td><td>试剂</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/122796" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td>122796</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 成像系统 200 系列</td><td>设备</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td>其他可用的 IVIS 型号包括：Lumina II、Lumina XR、Kinetic 和 Spectrum。</td></tr></tbody></table>

in vivo 活体成像转基因leishmania 寄生虫在活体宿主中的分布

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

不同的物种Leishmania, 一种原生动物寄生虫，属于科锥虫科，通常引起不同的人类疾病表现。最常见的疾病形式是内脏利什曼病（VL）和皮肤利什曼病（CL）。利什曼病的小鼠模型被广泛使用，但在小鼠感染后不同时间点定量寄生虫负荷需要处死小鼠。随后通过显微镜检查、有限稀释试验或对寄生虫DNA进行qPCR扩增来测量寄生虫载量。in vivo成像系统（IVIS）配备有集成的软件包，可检测与活体生物体内细胞相关的生物发光信号。为了最大限度减少动物使用量，并对个体进行纵向感染监测，适用于成像的体内模型Leishmania引起内脏利什曼病（VL）或皮肤利什曼病（CL）的利什曼原虫种（spp.）已被建立。将寄生虫经基因工程改造以表达荧光素酶，并通过皮内或静脉途径接种至小鼠体内。对转基因寄生虫中由荧光素酶驱动的生物发光进行定量测量Leishmania使用IVIS对小鼠体内的寄生虫进行成像。在纵向研究中，可以对同一只小鼠进行多次成像，从而评估实验初始接种寄生虫量在个体动物之间的差异，并评估寄生虫在小鼠组织中的增殖情况。该方法对皮肤部位的寄生虫具有高灵敏度检测能力。尽管内脏深层器官中的信号（光子/秒/寄生虫）很可能低于皮肤，但尚未开展表浅部位与深部部位信号的定量比较研究。因此，不同身体部位之间的寄生虫数量可能无法直接比较，但在相同组织间仍可进行小鼠间的寄生虫负荷比较。以下是一例内脏化物种的示例（L. infantum chagasi）以及一种引起皮肤利什曼病的物种（L. mexicana) 如图所示。IVIS 技术可用于监测和分析多种小型动物模型Leishmania引起人类不同形式利什曼病的物种。

一个 体内 成像系统用于对利什曼原虫（Trypanosomatid原生动物）感染小鼠的感染情况进行定量测量 利什曼原虫这是一种非侵入性且非致死性的方法，可用于在慢性感染过程中检测多种组织内表达荧光素酶的寄生虫。 利什曼原虫 种感染

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属于锥虫科（Trypanosomatidae）的利什曼原虫属（Leishmania）不同物种通常引起人类不同的疾病表现形式。最常见……

本实验的总体目标是在活体宿主中对利什曼原虫感染进行成像。首先通过构建转基因生物发光寄生虫来实现该目标。实验的第二步是用利什曼原虫感染小鼠。该实验步骤的第三步是使用IVIS对感染的小鼠进行生物发光成像。最后一步是分析生物发光数据。最终，可通过IVIS获得转基因利什曼原虫在活体小鼠中产生的生物发光的定量测量结果。该方法可对纵向研究中同一动物不同解剖部位的相对寄生虫负荷进行分析。大家好，我是科林·费尔（Colin Fer），爱荷华大学免疫学研究生项目的一名学生。我在玛丽·威尔逊（Mary Wilson）博士的实验室工作。您好，我是 Mary Wilson。我们在爱荷华大学内科医学、微生物学和流行病学系工作。我们还在爱荷华城退伍军人事务医疗中心工作。大家好，我是Lori，也叫Holman。我在Wilson实验室工作。今天我们将向您展示如何使用活体成像系统对活体动物宿主中的生物发光利什曼原虫寄生虫进行成像。我们在实验室中采用此方法研究小鼠的利什曼病感染疾病模型。现在开始操作。寄生虫在体外培养，并通过动物传代以维持其毒力。寄生虫的种类、剂量和感染途径由研究者确定。我们将演示两种感染途径：耳廓皮内感染和尾静脉注射感染。进行皮内感染时，需先通过腹腔注射液体麻醉剂对小鼠进行麻醉。用手牢固地抓住动物背部皮肤，使其腹部朝上、头部朝下，以实现手动固定。用70%乙醇或异丙醇清洁注射部位。将针头斜面朝上，略微倾斜放置。注射时，针尖应仅轻微刺入腹壁的较低区域。动物麻醉后，用酒精清洁感染部位。用10 µL寄生虫悬液装填注射器。在食指上套上保护套。此处使用一个常见的 50 毫升锥形管作为保护套。然后将小鼠仰卧放置，并用拇指和保护套夹住小鼠的耳朵。将针头以浅角度插入耳廓皮下，缓慢推动注射器活塞。皮肤表面可能会出现轻微鼓起。耳廓背面不应有液体渗出，否则表明针头已穿透耳廓。进行静脉尾部接种时，首先用200微升（µL）的寄生虫悬液装填注射器。接着，将小鼠置于加热灯下数分钟，然后转移至固定装置中。在食指上戴上保护套。用拇指和防护罩夹住动物的尾巴，并保持其相对绷紧。用酒精清洁注射部位。然后将针头以大致相同的角度插入尾部两侧静脉之一，位置位于尾部绕过防护指套处。当尾部缓慢下压注射器推杆时，静脉会呈现清晰的冲刷现象。除非针头斜面位于静脉外，否则下压推杆不应有阻力，皮肤也不应出现鼓泡。为准备荧光素酶注射，将荧光素酶用含或不含镁和钙的KO缓冲液磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，配制成浓度为15毫克/毫升的溶液，并使用0.2微米滤器对荧光素酶溶液进行过滤。 将D型荧光素酶分装后，可于-80摄氏度保存，直至使用前将其在水浴中复温至37摄氏度。用酒精清洁动物的注射部位。以每毫升15毫克的剂量对小鼠进行腹腔注射。在荧光素注射后约10至15分钟，以每公斤约150毫克的剂量将荧光素溶液溶于DPBS中。可使用IVIS进行动物成像：

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在Live主机转利什曼原虫寄生虫在体内成像

我们展示了利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因疟原虫进行脾脏活体显微成像的方法，并对疟原虫在该器官内的运动性及血流情况进行定量分析。...

活体脾脏显微成像：寄生虫运动性与血流的定量分析

感染THP1细胞的寄生虫拯救与转化实验 体外 与 Leishmania donovani...

一种针对THP1人急性单核细胞白血病细胞系内Leishmania donovani无鞭毛体的抗利什曼原虫药物筛选的寄生虫拯救与转化实验

本视频展示了一种用于定量检测寄生虫在骨髓来源巨噬细胞（BMMs）内生长的实验方法。巨噬细胞被运动型和非运动型侵袭期寄生虫感染，...

一种体外定量检测寄生虫在巨噬细胞内生长的实验方法

本文报道了一种利用活体显微成像结合特定图像采集与分析方法，对小鼠肝脏血管系统中单个血管内血流速度进行动态测量与定量的详细实验方法。...

肝脏活体显微成像 利什曼原虫 感染：肝脏血流动力学评估

在本方案中，使用荧光标记的 T. cruzi 被注入透明的斑马鱼幼鱼体内，并观察了寄生虫的运动性 体内...

建立幼体斑马鱼作为研究动物模型 克氏锥虫 运动性 在体 内

此处，我们提供了一套整合的实验方案，用于评估小鼠皮肤感染情况 Leishmania...

体内感染 Leishmania amazonensis 评估小鼠体内寄生虫毒力

本文描述了利用 pLEXSY 系统构建表达 eGFP 基因的稳定整合转基因L. panamensis和L.

Leishmania 物种菌株的构建及其eGFP的组成型表达

本方案详细描述了在Trypanosoma...

揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

本文通过生物发光成像和PCR技术，对经腹腔（IP）或牙龈内（IG）途径感染L. infantum-Luc的金黄地鼠进行纵向评估。在感染后第1天（1 dpi）、感染后第1周（8 dpi）和感染后第3周（22 dpi）对动物进行评估，并于感染后第50天（50th...

体内成像通过牙龈接种表达荧光素酶的无鞭毛体感染利什曼原虫婴儿株的仓鼠

本文介绍了一种无创的双光子（2P）显微成像方法，用于研究小鼠足垫中的白细胞归巢过程。我们讨论了组织成像制备过程中的技术细节，并指导读者完成从初始设置到实验实施及数据采集的典型实验流程。...

白细胞归巢与迁移的非侵入性成像 体内

了解活体利什曼原虫感染成像技术，通过IVIS系统对小鼠进行非侵入式生物发光成像。该方法可定量检测荧光素酶表达寄生虫，为研究慢性感染动态提供重要工具。

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