ショウジョウバエの胚の生体内の遠心

ショウジョウバエの卵の中の主要な細胞小器官を密度で分離することは、生後3時間未満の胚を採取することから始まります。その後、卵殻は装飾後に50%漂白剤でインキュベートすることにより取り除かれます。胚には、寒天にマウントされたステージが定義されています。

最終ステップとして、胚を遠心分離して回収し、明るい光と蛍光を使用して回収された胚を調べます。顕微鏡検査では、特定のタンパク質の特定の細胞小器官への局在が示されています。細胞内オルガネラを精製して単離するための主要な戦略は、密度によって他のすべての細胞成分から細胞内小器官を分離することですが、通常は分離しているタンパク質やオルガネラを遠心分離する前に細胞が破壊されるという課題があります。

メイは、これらの非天然のin vitro条件下で互いにくっつきます。逆に、一部のタンパク質は、通常は結合する構造から脱落する可能性があります。これから説明する手法の主な利点は、in vivoで密度による分離が可能になることです。

したがって、オープンセルとそれに伴うアーティファクトの破損を防ぎます。この方法は、細胞生物学的な重要な疑問に答えるのに役立ちます。これにより、共局在化実験が非常に容易になり、移植実験や生化学的分析のための特異的な有機画分を分離することができます。

この手順では、リンゴジュースを含有する高割合の寒天培地を調製し、添付の書面によるプロトコルに詳述されているようにプレートに注ぎます。プレートは、産卵ステップと、その後の胚の埋め込みおよび遠心分離の両方に使用されます。この手順は、卵の収集を開始することから始まります。

まず、ドライイーストを水と混ぜてピーナッツバターにイーストペーストを調製します。次に、コンシステンシーは、新鮮なリンゴジュース寒天プレートの一部をイーストペーストで覆います。成虫のハエはケージに入れられ、その底に寒天プレートが貼られています。

現在のプレートを取り外すには、フライケージを反転させてベンチトップに叩きつけます。ハエは数回底に落ち、この非常に短い期間に一時的に方向感覚を失います。古い寒天プレートを、イーストペーストを重ねた新しいプレートにすばやく交換します。

酵母は卵の生産に栄養を提供し、寒天のリンゴジュースと一緒に卵の層を誘導します。最初の30〜60分の卵コレクションを捨てます。それは、受精後に女性によって保持されていたため、誤って病期が誤った胚の大部分を生み出します。

その後の卵の収集は、受精直後に堆積した卵子によって支配される傾向があります。最も一貫した層状化は若い胚で達成されるため、最大3時間卵を収集します。収集時間は1時間以内と短いものが望ましいです。

日常的な実験では、ピンセットを使用して、酵母または寒天プレートの表面に付着したハエを取り除きます。卵子を採取した後、卵を取り出し、殻をむき、寒天プレートを解剖顕微鏡の下に置き、トランスイルミネーションにより胚を観察します。胚から卵殻を取り除くために、卵フィラメントを必ず特定してください。

寒天プレートの下に50%漂白剤を噴射し、胚を覆い、数分間インキュベートします。寒天プレートを時々攪拌して、漂白剤の中で胚を渦巻きます。顕微鏡で卵を再度調べます。

卵のフィラメントが見えなくなったら、コーリアンは正常に除去されました。これには通常、漂白剤溶液とのインキュベーションに3〜5分かかります。次に、金網バスケットをふるいとして使用して、胚を漂白剤から分離します。

バスケットは、中央にインデントされた金網の平らなシートの2センチ×2センチメートルの正方形から準備されます。ピンセットでワイヤーバスケットをつかみ、寒天プレートの逆さまのカバーにかざします。寒天プレートから漂白剤と胚スラリーを金網を通して寒天プレートの蓋に注ぎます。

寒天プレートに胚が残っている場合は、プレートに蒸留水を噴射して胚を取り除き、蒸留水と胚スラリーを金網に注ぎます。ワイヤーメッシュの底をペーパータオルに触れて、余分な液体を拭き取ります。次に、ワイヤーバスケットの周囲に沿って蒸留水を噴射して、胚の損失を最小限に抑えながら残りの漂白剤を洗い流します。

余分な液体を頻繁に拭き取ります。すべての漂白剤が除去されるまで、洗浄手順を5〜10回繰り返します。ワイヤーバスケットにまだ漂白剤の臭いがする場合は、胚を洗い続けてください。

胚が十分に洗浄されたら、寒天にマウントできます。ワイヤーバスケットから胚を洗い流します。TSSを空のシャーレに入れると、胚は底に沈むはずです。

解剖スコープで、トランス照明で胚を観察します。特定のステージを視覚的に容易に認識できます。P 200ピペットを使用して、目的の病期の胚を選択し、それらを小さな寒天プレートに移します。

胚が老化し、30分以上浸漬が長引くため、TSSではピペットを使用して発生に影響を与える可能性があります。キムワイプの下で。TSSのほとんどを取り外します。

寒天の表面は少し湿っている必要があり、これにより胚を押しやすくなります。ただし、遠心分離中に過剰な液体があると胚が穴から滑り落ちるため、プレート上のどこにも液体のプールが残ってはいけません。この手順の最も難しい側面は、胚とオーガーの取り付けです。

胚はデリケートで、簡単に破壊して乱暴に扱うことができるため、これは特に困難です。これを防ぐには、針をゆっくりと、慎重に、少しずつ動かす必要があります。練習は、胚がどれだけの接触と圧力に耐えることができるかを正確に学ぶための最良の方法です:舌と針を針ホルダーに後方に取り付けて、観察中に鈍い端が突き出るようにします。

顕微鏡下では、針を使って各胚の近くの寒天に縦穴をあけて、寒天に穴を突っ込みながら顕微鏡下で同時に観察できるようにし、針を斜めに保持します。したがって、完全に垂直に穴をあけるのは難しいです。しかし、針のわずかな傾斜により、穴の片側にわずかなくぼみまたは溝ができ、胚はそれに沿って穴に滑り込みやすくなります。

次に、細長い胚の前端と後端を特定し、胚を一貫した向きで穴に押し込む必要があります。典型的には、前端が上になると、前端のign膜は特殊な構造によって特徴付けられる。マイクロパイルは、針の鈍い端を使用して、胚を押して寒天に沿って移動させ、その後端を穴の開いた穴に向けて向きを変えて操作します。

次に、前端を穴に向かって押します。胚は、穿刺中に発生するわずかなくぼみに沿って穴に簡単に滑り込む必要があります。胚が上に傾いたら、穴の奥深くに押し込みます。

寒天は十分に柔らかいので、突いた穴に胚を部分的に挿入すると、損傷することなくさらに押し込むことができます。完全に押し込まれると、胚は通常すでにかなり垂直になっています。挿入された胚をより垂直に整列させない場合は、横に押しています。

穴が大きすぎない場合、遠心分離中、胚の位置は寒天によって安定して保持されます。練習を重ねれば、1プレートあたり100〜250個の胚を埋め込むことが可能です。必要な胚の数は、ダウンストリームアプリケーションによって異なります。

取り付け時間を短くしてください。マウント中に胚が成長し続けるため、発生段階を狭くしたい場合は、湿ったフライブラシで残った未使用の胚を取り除きます。次に、胚を寒天に遠心分離機でマウントした。

ハエの胚を保持しているプレートを、遠心寒天天のスイングバケツを下にして移します。遠心分離機が均等にバランスが取れていることを確認し、プレートを毎分 4 、 000 回転で 30 分間、摂氏 4 〜 10 度で遠心分離します。遠心分離後、寒天プレートを解剖顕微鏡の下に置き、針の鈍い端を使用してTSSの層で覆います。

胚を穴から掘り出します。胚はTSSに浮かんでいますが、水没したままです。胚は、前端に茶色のキャップ、透明な中央領域、後端に暗い灰色の領域で明らかに層状に見えます。

明視野顕微鏡またはエピ蛍光顕微鏡による直接観察のために、明確な層状化を示さない胚を廃棄します。P 200ピペットを使用して、TSSのウェルレイヤード胚をマイクロ遠心チューブに移します。次いで、バッファー内の胚をスライドガラス、添付の書面によるプロトコルに記載されているマウントに移します。

胚を固定する場合は、P 200ピペットを使用して、TSS内のよく層状にされた胚をシンチレーションバイアルに移します。標準的な固定技術を使用して胚を固定します。なぜなら、遠心分離胚の場合、失活ステップの効率は低い。

できるだけ多くの胚から始めます。移植実験で胚を使用する場合は、胚を寒天プレートに移し、カバースリップに装着してください。標準的な胚処理手順を使用して、そのような手順への参照は、書面によるプロトコルで見つけることができます。

遠心分離によって誘発される層状化は、数十分間安定しています。これは、遠心分離前の生きたoph胚の明るい光の画像で、前端が左側、後端が右側に示されています。上側と腹側を下向きの卵割期の胚は均一に現れます。

このような茶色のステージは、in vivo遠心分離に最適です。ブラスター皮膚胚は、すべての側面が類似しているように見える透明な縁を持っています。この明確な周辺は、化の終わり近くまで拡大します。

胚は、化が終了するまで遠心分離によってうまく層別化できます。ヨークと核の層状化は、切断段階ほど一貫していません。細胞胚が非対称に見えると、背側と腹側の腹側が区別され、さまざまなひだが発生します。

示されている胚は、初期の胚帯伸長にあります。これらの段階では、遠心分離は主要な細胞小器官の層別化に効果的ではなくなります。胚形成は連続体です。

したがって、これらの段階は個別のエンティティではなく、開発が進むにつれて互いに変化します。このタイムラプスムービーは、卵割段階から4時間の胚発生を捉えています。ジャームバンドの延長により、720倍にスピードアップします。

これは、トランス照明を使用して撮影された遠心分離機の胚の画像です。左側の胚はよく層状になりました。低密度の脂肪滴は、非常に前方の先端で脂質キャップを形成します。

高密度の卵黄ビヒクルは、後端に濃い灰色のゾーンとして蓄積します。これらの2つの層は、他の細胞小器官と細胞質を表す広い透明物で区切られています。右側の胚は、化後に遠心分離されました。

落射蛍光顕微鏡が利用可能な場合、層状化は最小限に抑えられます。これらの生きた遠心分離された胚は、卵黄が強い青色水蛍光を示すUV励起下で調べることができます。後極にある自家蛍光物質のコンパクトな層は、遠心分離が成功したことを示し、後端のマーカーとして機能します。

胚が固定されている場合、層の外観は劇的に変化します。脂質液滴は半透明になり、脂質層は暗褐色ではなく明るい光顕微鏡で白っぽくふわふわに見えます。Yo corsoの蛍光は、固定によって部分的または完全に破壊され、強度が大幅に低下するか、検出できなくなることさえあります。

この画像では、オルガネラは蛍光マーカーで標識されており、マーカーは前後軸に沿って特徴的な位置に蓄積します。特定のヒストン融合タンパク質は、脂質液滴と核の両方に局在しているため、これらの細胞コンパートメントをマークするだけでなく、標識された核の数によって胚のステージを監視するために使用できます。ご覧のとおり、この手順の最も困難な側面の1つは、胚をオーガーに埋め込むことです。

しかし、少し練習すれば、これを迅速かつ効率的に行うことができます。一度マスターしたら。この手法により、面倒な共局在実験が非常に簡単になります。

例えば、当研究室では、この手法を日常的に使用して、目的のタンパク質が特定の主要なオルガネラに局在するかどうかを蛍光顕微鏡で試験しています。さらに、遠心分離機の胚から個々の層を回収して、生化学的分析や移植実験を行うことができます。この技術は、ショウジョウバエの胚に役立つだけではありません。

また、遠心分離は、他の種の卵子や細胞などの他の大きな細胞タイプの細胞の密度によって細胞小器官を分離します。