Name: Misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche Utilizzando una trappola ottica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Impara a misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche filamentose di E. coli utilizzando una trappola ottica. Questo metodo consente di studiare le proprietà meccaniche cellulari in modo non invasivo.

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Riconosciamo consigli utili da Mingzhai Sole su cellule vincolanti alle superfici. Ringraziamo Ned Wingreen e zemer Gitai per le discussioni importanti. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health concedere P50GM07150, National Science Foundation riconoscimento alla CARRIERA PHY-0844466 e la Fondazione Alfred P. Sloan.

<ol><li> Crescere le cellule di E. coli in brodo Luria-Beltrani (LB), medio-fase esponenziale (OD = 0,2-0,4). </li><li> Far crescere la coltura in LB integrata con 50 mg / ml di cefalexina per 15 minuti per indurre la crescita filamentosa, e poi concentrare la cultura di 5 volte tramite centrifugazione. </li><li> Fai PEI rivestite da copri scorre 1% polyethylenimine diluito in acqua in una camera di flusso, e lavare con acqua dopo 5 minuti di incubazione. </li><li> Flusso della cultura concentrato di cellule nella camera, e lavato con una miscela di LB e cefalexina (50μg/mL) dopo 3 min per rimuovere le cellule senza legami. </li><li> Incubare la camera a 37 ° C per 30 min-1 ora per far crescere le cellule attaccato prima di posizionarlo nello strumento ottico cattura. </li><li> Fai polilisina rivestite perle incubando 0,5 micron di diametro perle di polistirene (Labs Bangs) nel 0,1% polilisina diluito in acqua per 30 min. Quindi lavare le perline 3 volte e risospendere in acqua. </li><li> Diluire il tallone di un fattore due in LB con cefalexina (50μg/mL), e aggiungerlo nella camera di flusso. </li><li> Otticamente intercettare un galleggiante tallone e toccare alla punta libera di una cella. (Usiamo un Mad City Labs fase piezoelettrici per il controllo del moto del campione.) Quando una combinazione adatta perla / cellula viene trovato, lavare la camera con cefalexina in LB (50μg/mL) per rimuovere perline separati. </li><li> Eseguire programma appositamente scritto LabView di applicare forze di piegatura alla cella e registrare forza-spostamento dei dati. Dettagli del programma <ol class="lalpha"><li> Calibrare la risposta del rivelatore da raster scansione del tallone allegato all'interno del raggio laser di rilevamento e la registrazione di segnali in tensione 3D PSD. </li><li> Identificare asse lungo cellula immagine al microscopio. </li><li> Spostare celle a passi in una direzione perpendicolare all'asse lunga cella. </li><li> Registrare la distanza percorsa e lo spostamento dalla trappola ottica. </li><li> Conversione spostamento di forza applicata con la rigidità trappola precedentemente misurati e salvare spostamento punta e forza in un file. </li></ol></li></ol> Segreti di successo: Nel passaggio 8), si ha la necessità di trovare una cella con un ben definito fine bloccato. Alcune cellule sono semplicemente bloccati in una sola punta, e la forza di piega alla punta che conduce a un insieme di cellule girevole, piuttosto che piegarsi. Una coppia adatta si trova piegando ogni cella rapidamente a mano utilizzando il joystick controllato movimento palco. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. La figura mostra forza-spostamento di dati per una singola cella. La pendenza di questa linea è la rigidezza flessionale della cellula.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

La produzione video di questo articolo è stato sponsorizzato da Mad Città Labs, che produce strumenti utilizzati in questi studi.

Il protocollo presentato qui è progettato per misurare quantitativamente la piegatura delle cellule batteriche. Il setup esperimento può essere applicato a qualsiasi forma di bastoncello cella che può essere fatto per crescere filamentously. Abbiamo usato con successo questa configurazione per sondare gli effetti dei filamenti del citoscheletro sulla rigidità alla flessione di E. coli cellule. Questa stessa tecnica può essere usata per valutare i ruoli di pressione, rigidità della parete cellulare e gli altri componenti intracellulari nella determinazione complessiva rigidità alla flessione delle cellule.

<table><tbody><tr><td>cefalexina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>polietilenimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>polilisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>microsfere di polistirene di diametro 0,5-&amp;mu;m</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>Sistema nanoposizionatore Nano-LP Series</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche utilizzando una trappola ottica

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Abbiamo sviluppato un protocollo per misurare la rigidità flessione di filamentose a forma di bastoncello batteri. Le forze sono applicate con una trappola ottica, un microscopico tridimensionale primavera fatta di luce che si forma quando ad alta intensità del fascio laser viene focalizzato in un punto molto piccolo da lente dell&#39;obiettivo di un microscopio. Per piegare una cella, per prima cosa si legano batteri vivi ad un trattato chimicamente coprioggetto. Poiché queste cellule crescono, la metà delle cellule rimane vincolato alla coprioggetto, ma le estremità in crescita sono liberi di questa restrizione. Inducendo crescita filamentosa con la cefalexina droga, siamo in grado di identificare le cellule in cui è stato bloccato un&#39;estremità della cellula per la superficie, mentre l&#39;altra estremità è rimasto libero e suscettibile alle forze di flessione. A forza di piega viene poi applicata con una trappola ottica di associazione di un polilisina rivestita tallone alla punta di una cellula in crescita. Sia la forza e lo spostamento del tallone sono registrati e la rigidezza flessionale della cellula è la pendenza di questa relazione.

Vi presentiamo un protocollo per la piegatura di cellule batteriche filamentose attaccato ad una copertura antiscivolo della superficie di un dispositivo ottico per misurare la rigidità cellulare flessione.

Misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche Utilizzando una trappola ottica

Abbiamo sviluppato un protocollo per misurare la rigidità flessionale di batteri filamentosi a forma di bastoncello. Le forze vengono applicate tramite una trappola ottica, un microscopio...

Per determinare la rigidità flessionale di singole cellule di coli, coltivare innanzitutto i batteri fino alla fase esponenziale, quindi attaccarli su una superficie di coprioggetto trattata chimicamente. Lasciare che le cellule già aderenti alla superficie continuino a crescere in modo da sviluppare estremità flessibili. Successivamente, introdurre flusso di microsfere dielettriche, intrappolare una microsfera e piegarla verso l'estremità flessibile di una cellula.L'ultimo passaggio della procedura consiste nel piegare la cellula con il trappolamento ottico e misurare i dati risultanti di spostamento forzato. La rigidità flessionale della cellula può essere calcolata mediante un'analisi di regressione lineare sui dati di spostamento forzato. Ciao, sono Steven Wong del laboratorio del Professor Joshua Shere presso l'Istituto Louis Sickler di Genomica Integrativa e il Dipartimento di Fisica dell'Università di Princeton.Oggi vi mostreremo una procedura per piegare singole cellule batteriche e misurare la rigidità cellulare. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il contributo di diverse strutture intracellulari all'integrità meccanica delle cellule batteriche. Cominciamo dunque.Per iniziare questa procedura, coltivare tre millilitri di cellule di e coli in mezzo LB fino alla fase esponenziale. Una volta che le cellule raggiungono una densità ottica a 600 nanometri compresa tra 0,2 e 0,4, aggiungere alla coltura 50 microgrammi per millilitro di cefalexina per 15 minuti per indurre la crescita filamentosa. Durante questi 15 minuti, preparare una camera di flusso.Attacca due pezzi di nastro biadesivo con un intervallo di tre millimetri tra loro su un vetrino e fissa un'altro vetrino coprioggetto sulla parte superiore. L'intervallo tra i pezzi di nastro crea un canale per il flusso del liquido. Rivesti il vetrino coprioggetto con PEI facendo fluire 10 microlitri di polietilene al 1% diluito in acqua nella camera di flusso mediante una micropipetta e incuba per cinque minuti.Quindi lavare facendo passare 200 microlitri di acqua in un'estremità della camera e raccogliendola all'altra estremità mediante vuoto. Dopo 15 minuti di crescita dei batteri in presenza di cefalexina, centrifugare un millilitro di cellule in una microcentrifuga e risospendere in 200 microlitri di LV con cefalexina. Successivamente, utilizzare nuovamente una micropipetta a un'estremità e il vuoto all'altra estremità per far fluire 50 microlitri della coltura cellulare concentrata nella camera contenente il coverslip rivestito e incubare per tre minuti.Quindi lavare con 50 microlitri di Vel B integrato con cefalexina. Per rimuovere le cellule non aderenti, incubare la camera a 37 gradi Celsius per 30 minuti fino a un'ora, in modo da permettere alle cellule aderenti di crescere, prima di posizionarle sullo strumento di optical trapping durante l'incubazione. Preparare le microsfere rivestite con polilisina incubando tre microlitri di microsfere di polistirene con diametro di 0,5 micrometri in una soluzione di polilisina 0,1% diluita in acqua per 30 minuti.Una volta terminata l'incubazione delle perle, lavarle tre volte centrifugandole in una microcentrifuga e risospendendole in un millilitro di acqua; procedere quindi ad associare le perle ai batteri e misurare la rigidità di legame delle cellule. L'aspetto più difficile di questo protocollo consiste nel saper ricercare, localizzare e riconoscere una cellula adatta per le misurazioni della flessione e della rigidità. Una cellula adatta è quella con un'estremità ben definita fissata e un'estremità libera.Esaminare al microscopio la camera a flusso per individuare una cellula con un'estremità ben fissata. Alcune cellule sono attaccate soltanto a un'estremità, e la forza flessionale all'altra estremità provoca una rotazione dell'intera cellula piuttosto che una flessione. Per trovare una cellula adatta, flettere rapidamente ciascuna cellula con il trappolamento ottico utilizzando il movimento dello stadio controllato dal joystick.Quando si trova una cellula adatta, diluire la soluzione di perline di un fattore due in lb con cefalexina, aggiungere 30 microlitri della soluzione di perline alla camera di flusso pipettando in un'estremità ed estraendo delicatamente dall'altra estremità con un fazzoletto Kim per intrappolare otticamente una perla libera e toccare la punta libera di una cellula. Lavare nuovamente la camera mediante micropipetta e utilizzando un fazzoletto Kim bianco con 50 microlitri di cefalexina in LB per rimuovere le perline non attaccate. Successivamente, eseguire un programma personalizzato scritto in LabVIEW per applicare forze flessionali alla cellula e registrare i dati di spostamento forzato.Per prima cosa, calibrare la risposta del rivelatore eseguendo una scansione RA della perla collegata all'interno del fascio laser di rilevamento e registrando i segnali di tensione PSD 3D. Successivamente, identificare l'asse maggiore della cellula in un'immagine al microscopio. Dopo aver identificato l'asse longitudinale della cellula, spostare la cellula a passi in una direzione perpendicolare all'asse maggiore, registrando contemporaneamente la distanza percorsa e lo spostamento della perla rispetto al centro del trappola ottica.Infine, convertire i valori di spostamento in forza applicata utilizzando la rigidità della trappola precedentemente misurata e salvare. Lo spostamento della punta e la forza registrati in questo file rappresentano dati di forza-spostamento per una singola cellula. La pendenza di questa retta corrisponde alla rigidità flessionale della cellula.Abbiamo appena mostrato come combinare la rigidità flessionale di E. coli con un trappola ottica. Quando si utilizza questo procedimento, è importante ricordarsi di trovare una buona cellula con un'estremità ben definita bloccata e un'estremità libera. È tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Un metodo è descritto per selezionare individualmente, manipolare e agenti patogeni immagine dal vivo utilizzando una trappola ottica accoppiato ad un microscopio a disco rotante. La trappola ottica fornisce il controllo spaziale e temporale di organismi e li adiacenti alle cellule ospite. Microscopia a fluorescenza cattura le interazioni intercellulare perturbazione con minimo di cellule.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Viene presentato un protocollo per il lancio e l'intrappolamento stabile di microparticelle dielettriche selezionate nell'aria.

Optical Trappola Caricamento di dielettrico microparticelle in aria

Molte proteine nella cellula senso e inducono la curvatura della membrana. Descriviamo un metodo per tirare nanotubi di membrana da vescicole lipidiche per studiare l'interazione delle proteine o qualsiasi molecola di curvatura-attivo con membrane curvo in vitro.

Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

Presentiamo una configurazione di pinzette ottiche accoppiate al microscopio un foglio leggero e la sua attuazione a sonda meccanica delle cellule senza perline nell'embrione della drosofila .

Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila

Questo protocollo mira ad automatizzare le misurazioni AFM su centinaia di cellule microbiche. In primo luogo, i microbi vengono immobilizzati nelle microstrutture di francobolli PDMS e quindi le misurazioni della spettroscopia di forza vengono eseguite automaticamente su centinaia di cellule immobilizzate.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Qui viene descritto un protocollo integrato basato su pinzette ottiche e microscopia di defocalizzazione per misurare le proprietà reologiche delle cellule. Questo protocollo ha ampia applicabilità nello studio delle proprietà viscoelastiche degli eritrociti in condizioni fisio-patologiche variabili.

Analisi quantitativa delle proprietà viscoelastiche dei globuli rossi mediante pinzetta ottica e microscopia di defocalizzazione

Viene presentata e discussa la formazione di fasci di actomiosina in vitro e la misurazione della generazione della forza dell'insieme di miosina utilizzando pinzette ottiche.

Sondare la meccanica dell'ensemble di miosina in fasci di filamenti di actina usando pinzette ottiche

Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l'intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all'interno delle reti di microtubuli attivi.

Misurazione diretta delle forze all'interno di fasci di microtubuli attivi ricostituiti

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Impara a misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche filamentose di E. coli utilizzando una trappola ottica. Questo metodo consente di studiare le proprietà meccaniche cellulari in modo non invasivo.

Misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche Utilizzando una trappola ottica

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