Введение в Worm Лабораторная работа: от культивирования червей для мутагенеза

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы выполнить два различных протокола мутагенеза, которые обычно используются для создания мутантов и нематод, таких как ceno, hepatitis elegance и prisca. Мутагенез Pacificus является мощным инструментом для раскрытия функции генов. Это достигается путем предварительной подготовки культур с большим количеством червей на последней личиночной стадии перед взрослостью жизнью, с помощью которых будет проводиться мутагенез.

Следующим шагом является мутация червей с помощью двух альтернативных методов: этилметана, обработки сульфонатами или лечения язвы и мутагенеза в сочетании с ультрафиолетовым излучением. Третьим этапом процедуры является перенос здоровых на вид червей в сельскохозяйственные тарелки, только что засеянные бактериями, которые являются источником пищи. Заключительным этапом процедуры является скрининг мутантных фенотипов, представляющих интерес в первом, втором или третьем поколении.

Здравствуйте, ам Джоре из лаборатории доктора Андре Переса, Сильвы на биологическом факультете Техасского университета. В Арлингтоне процедуры мутагенеза T-M-P-U-V и EMS помогают ответить на ключевые вопросы в области генетических исследований, например, какие гены участвуют в биологических процессах, играющих важную роль в процессе развития. Здравствуйте, меня зовут Маниш Фар, хотя методы мутагенеза будут продемонстрированы для Pristi Onca S Pacificus, они могут быть очень часто использованы для других экспериментальных моделей, таких как нематода Sea Elegance, и даже позвоночных, таких как данио-рерио.

Итак, приступим. Наш выбор для переноса червей с одного места на другое изготовлен из проволоки 30 калибра, 90% платины и 10% иридиевой проволоки. Хотя некоторые исследователи могут предпочесть немного другой состав металлов для изготовления кирки, для удержания кирки также используется пастбищная пипетка.

Начните с того, что сломайте удлиненный кончик пастбищной пипетки до необходимой длины. Отрежьте примерно три-четыре сантиметра проволоки и поместите на нее 0,5 сантиметра. Внутри кончика пастбищной пипетки запечатайте провод в стакан над горелкой Бунзена.

Длина проволоки, выступающей из стекла, составляет около трех-трех с половиной сантиметров, но может варьироваться в зависимости от индивидуальных предпочтений. Разровняйте конец выступающей проволоки с помощью плоскогубцев. Затем согните расплющенную часть вверх, чтобы получился совок.

Наконец, сгладьте острые края кирки наждачной бумагой, чтобы не повредить червя или агар. Чтобы собрать червей, простерилизуйте проволоку кирки на пламени, а затем протащите сплющенный кончик по бактериальной лужайке на древесной пластине NGMP, чтобы покрыть кончик густыми липкими бактериями. Будьте осторожны, чтобы не проколоть или не повредить агроповерхность с помощью стереомикроскопа очень легко.

Прижмите липкий кончик к червю, которого нужно собрать, пока червь не прилипнет к бактериям на кирке. Как только червь окажется на кончике кирки, немедленно перенесите ее на новую пластину, коснувшись или скользнув кончиком кирки по бактериальной лужайке новой пластины. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить агроповерхность пластины, где черви могут заползти в отверстия и их будет трудно достать.

Червь должен сползать с кирки, когда вы касаетесь или скользите кончиком кирки по бактериальной лужайке. Червь не должен оставаться на кирке слишком долго, иначе он может высохнуть. Мы продемонстрируем EMS-мутагенез на четырех-пяти шестисантиметровых пластинах Петри червей prisca pacificus на третьей личиночной ювенильной стадии.

Смойте червей с каждой пластины, используя два-три миллилитра стерильных М девяти на каждую пластину. Червей должно быть несколько сотен. Соберите червей в стерильную одноразовую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Центрифугируйте при давлении 1500 G в течение пяти-семи минут или до тех пор, пока черви не сформируют гранулы. Аспирируйте жидкость и используйте два миллилитра М 9 для ресуспендирования червей в двойных перчатках и работая в вытяжном шкафу при 20 микролитрах EMS в трубку, содержащую два миллилитра М 9, и встряхните, чтобы растворить ее. Затем добавьте это к двум миллилитрам суспензии червей и аккуратно взболтайте.

Конечная концентрация EMS составит 47 миллимоляров. Поместите центрифужную пробирку с параформой на низкоскоростную коромысло в вытяжном шкафу и дайте червячкам инкубироваться в течение трех с половиной часов. В конце инкубации продолжительностью три с половиной часа поместите трубку в вертикальное положение и инкубируйте до тех пор, пока червь не опустится следующим, отасуньте наднатант и выбросьте его в стакан, содержащий один нормальный гидроксид натрия, чтобы инактивировать EMS в надосадочной жидкости.

Каждый раз перед тем, как вынимать руки из вытяжного шкафа, обязательно ополаскивайте их также в одном обычном гидроксиде натрия. Чтобы инактивировать EMS, добавьте пять миллилитров M nine к червям. Переверните трубку от 25 до 30 раз, чтобы промыть червей, и центрифугируйте при 1500 G в течение пяти-семи минут или до тех пор, пока черви не сформируют гранулу после центрифугирования, аспирируйте надосадочную жидкость и выбросьте ее в один нормальный пикер гидроксида натрия.

Повторите этот этап промывки, добавив М девять центрифузии и удалив сна, по крайней мере, три раза. После окончательной промывки операционную суспензию червячной суспензии в минимальном количестве М девять, пипетку суспензии червячной суспензии на пластины NGM, содержащие газон из бактерий OP 50. Дав жидкости высохнуть в течение нескольких минут, соберите и перенесите здоровых на вид четырех личинок J в свежезасеянные пластины.

Дайте мутагенным червям самооплодотвориться примерно через 8-10 дней, используйте стереомикроскоп для скрининга фенотипов F второго поколения на предмет чрезмерного количества мутантов, представляющих интерес. Эта процедура мутагенеза будет продемонстрирована на червях ppac pacificus из четырех-пяти шестисантиметровых пластин Петри, собранных в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Добавьте 10 миллилитров М девять в гранулу червя.

Переверните 20 раз, чтобы промыть червей, и центрифугируйте при 1500 G в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования. Повторите промывание червей М девять в общей сложности три раза после окончательного промывки, отсасывайте жидкость и ресуспендируйте червей примерно в 10 раз больше их объема М 9.

Затем добавьте 4, 5, 8 триметилSOREIN или TMP из трех миллиграммов на миллилитр, чтобы получить конечную концентрацию 30 микрограммов на миллилитр. ТМП инкубируют трубку в темноте при комнатной температуре на низкоскоростной коромысле в течение 15 минут. После инкубации установите трубку вертикально на 10 минут, чтобы все черви утонули для этого видео, трубка показана без крышки, но раствор TMP не должен подвергаться воздействию света.

Поскольку это химическое вещество чувствительно к свету, используйте прошлую пипетку, чтобы удалить червей со дна пробирки и перенести их на невставленную пластину NGM. Держите пластину в темноте, пока излишки TMP не впитаются в пластину. После того, как TMP впитается в пластину, червей можно обрабатывать ультрафиолетовым светом.

Одним из наиболее важных этапов процедуры УФ-нейрогенеза ТМП является обеспечение правильного расстояния между длинноволновым источником УФ-излучения и пластиной. Поэтому нам нужно пару раз отрегулировать расстояние, чтобы получить правильную интенсивность ультрафиолетового света, падающего на пластину. Интенсивность должна регистрироваться измерителем интенсивности, и она должна составлять 500 микроватт на квадратный сантиметр.

На этом этапе следует использовать правильные очки из-за потенциального риска ультрафиолетового излучения. С помощью УФ-измерителя интенсивности. Определите расстояние от длинноволнового источника ультрафиолетового излучения, которое приведет к интенсивности 500 микроватт на квадратный сантиметр.

Затем снимите алюминиевую фольгу и крышку и поместите пластину с обработанными TMP червями на расстоянии от лампы так, чтобы интенсивность на пластине составляла 500 микроватт на квадратный сантиметр. Подвергните пластину воздействию длинноволнового ультрафиолетового излучения на 50 секунд, накройте крышкой и оставьте червей в темноте на пять часов при комнатной температуре. Через пять часов соберите и перенесите здоровых на вид четырех личинок J в свежезасеянные пластины.

Наконец, проведите скрининг F1, F two или F 3 поколения на фенотипы, представляющие интерес, с помощью стереомикроскопа. Здесь показаны некоторые из мутантных фенотипов ppac pacificus, идентифицированных в F втором поколении после мутагенеза EMS или T-M-P-U-V. Две верхние панели на этих изображениях являются примерами гермафродита дикого типа и самца дикого типа.

Каждый мутант имеет характерный фенотип, который легко отличим от животного дикого типа. Панель C — пример мутанта. На панели D показан нескоординированный мутант, а на панели E изображен мутант-трансформер После освоения EMS-мутагенез может быть выполнен за четыре с половиной часа, а TMP uuv-мутагенез может быть выполнен за пять с половиной часов, если он выполнен правильно.

Этот временной промежуток также включает в себя время инкубации. Не забывайте, что EMS и TMP чрезвычайно опасны, и при работе с ними необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как ношение халата с использованием двойных перчаток, использование вытяжного шкафа и защитных очков. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.