والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

مرحبا ، أنا مات ما نيتون من الجامعة التقنية في الدنمارك. مرحبا ، وأنا ريبا من جامعة كوبنهاغن. نحن نعمل على الخميرة والأغشية الحيوية البكتيرية في أنظمة خلايا التدفق وفي هذا الفيلم سنوضح لك كيفية إعداد نظام خلية التدفق والأغشية الحيوية المرئية بواسطة ميكروفون قابل للتحويل.

هل يجب أن نفعل ذلك الآن؟ نعم بالتأكيد. اسمح لي بفعلها.

لصق خلايا التدفق. توجد خلايا التدفق بين مصيدة الفقاعات وزجاجة النفايات. الآن سنوضح لك كيفية الإرفاق.

هذه طبقة لخلية التدفق. يتم ذلك من خلال المكونات العديدة التي تراها على الطاولة. يتم تقطيع طرف 200 ميكرولتر إلى قطعتين.

يتم الآن إدخال الجزء الرفيع في حقنة ، والتي ستصبح الأداة المثالية لتطبيق خطوط رقيقة من السيليكون. من أجل لصق زجاج الطبقة بخلية التدفق ، ادفع الطرف الرفيع خارج المحقنة. الآن ، من أجل تسهيل تطبيق السيليكون على قاعدة خلية التدفق ، قم بقطع الجزء الخارجي من الطرف ، وأخرج المكبس وقم بتطبيق كمية مناسبة من السيليكون في المحقنة.

ضع المكبس مرة أخرى في المحقنة وادفع القليل من السيليكون للخارج للتأكد من اختفاء جميع الفقاعات. ابدأ الآن في تطبيق خطوط رفيعة من السيليكون على خلية التدفق. حاول عمل خطوط ناعمة وغير منقطعة من السيليكون لخلية التدفق.

سيضمن ذلك أن السيليكون سوف يعلق بالتساوي على الطبقة السفلية عند تطبيق السيليكون في الاتجاه المعاكس. تأكد من عدم خدش الخطوط التي تم إنشاؤها بالفعل ، ولكن حاول رفع الطرف برفق أثناء تقدمك ، وبهذه الطريقة ستتأكد من عدم وجود فتحات في خطوط السيليكون إلى تسرب بين الغرف أو من خارج خلية التدفق. خذ غطاء زجاج وضعه برفق فوق خطوط السيليكون على خلية التدفق.

كما هو موضح هنا ، سوف يلتصق زجاج الغطاء بسهولة بغراء السيليكون. اقلب خلية التدفق وادفع برفق الجزء الخلفي من خلية التدفق بأصابعك. سيضمن ذلك أن زجاج الغطاء سوف يعلق بطريقة مسطحة وفقا للسطح المسطح للطاولة.

الآن لعمل ختم مثالي أو لمحاولة تصحيح مناطق الختم ، ادفع برفق لأسفل باستخدام أداة كمكبس من حقنة. افعل هذا بعناية فائقة. كما يمكن أن ينكسر زجاج الغطاء بسهولة.

من خلال القيام بذلك ، ستتمكن من عمل ختم أفضل وربما تكون قادرا على تصحيح المناطق المزعجة في نهاية المطاف لتجنب التسريبات التي تفحص خلايا التدفق. من أجل إجراء تجربة ناجحة ، من المهم فحص خلايا التدفق بعد تصلب السيليكون. نعرض هنا خلية تدفق ذات ختم غير مثالي ، مما سيؤدي بلا شك إلى تسربات وتجميع مصائد الفقاعات وربط الأنابيب.

توجد مصائد الفقاعات بين المضخة وخلايا التدفق. نعرض هنا المكونات المختلفة لاستخدام مصائد الفقاعات الحيوية DTU. إنها ملفقة بطريقة تضمن أن الفقاعات محاصرة في النظام وأن الوسائط التي لا تحتوي على فقاعات هي الوحيدة التي ستدخل خلايا التدفق.

يتم وضع خمس محاقن مليلتر فوق كل فوهة خاصة. في مصيدة الفقاعات ، يتم تأمين ختم محكم بواسطة الحلقات القديمة. على كل فوهة ، ضع غطاء على كل من المحاقن.

الآن ، نظرا لأن هذا سيكون الاتصال لخلايا التدفق ، تأكد من إرفاق الأنابيب الطويلة لخلية التدفق لتتمكن من الوصول إلى مجهر متحد البؤر. يجب توصيل هذه الأنابيب بمصائد الفقاعات حيث يكون للحافة السفلية للفوهة مخرجها. نظرا لأن حافة الدخول في مصيدة الفقاعات أعلى من حافة الخروج ، فإن الفقاعات غير قادرة على مغادرة المحقنة وإدخال مرفق خلية التدفق لخلايا التدفق بمصائد الفقاعات.

توجد خلايا التدفق بين مصائد الفقاعات وزجاجة النفايات. هنا مطلوب وجود أنابيب طويلة حتى تصل خلية التدفق إلى المجهر متحد البؤر. مرة أخرى ، تأكد من توصيل المتدفق بالجانب الصحيح من مصيدة الفقاعات. هنا.

لاحظ الأنابيب الطويلة المؤدية إلى التدفق من مصيدة الفقاعات. يمكن أن يختلف هذا بالطبع في بناء إعداد واحد. الآن قم بإبطال جميع الأنابيب بإحكام بتجميع خلية التدفق الخاصة بنظام مصائد الفقاعات بالمضخة والموصلات T.

لأنابيب تغذية الوسائط. بالنسبة للمضخة التمعجية ، نستخدم أنابيب RIN. هذا النوع المحدد من الأنابيب قادر على تحمل الضغط الميكانيكي من المضخة.

قم بإعداد أنبوب لكل غرفة من الغرف في خلايا التدفق. سنوضح هنا الآن كيفية تجميع الأنابيب التي تنتقل من زجاجة الوسائط إلى المضخة. قم بقص أنابيب السيليكون إلى قطع ذات حجم مناسب وقم بتوصيلها بموصلات T.

قم بتجميع الأنابيب بحيث يكون هناك اتصال واحد لكل من أنابيب الدماغ في المضخة. تأكد من عمل أنبوب لكل غرفة في خلية التدفق. حاول أن تجعل الأنابيب الخاصة بك قصيرة قدر الإمكان للحصول على نظرة عامة أسهل على اتصالاتك.

الآن من أنبوب التغذية المركزي المرفق بموصلات T ، الأنابيب القصيرة التي يمكن توصيلها بأنابيب ING في المضخة. تأكد من أن أنابيب السيليكون متصلة بإحكام بالموصلات. الآن مع أنابيب تغذية الوسائط على الجانب الأيسر من المضخة ، سنقوم الآن بإرفاق بقية النظام بالمضخة.

فيما يلي الأنابيب التي تذهب إلى صواني الفقاعات متصلة بأنابيب الصرف. مرة أخرى ، هنا سوف تخفف نظرة عامة على تجربتك. إذا كنت تعرف الأنابيب التي تذهب إلى أي اتصال في المضخة ، فإن طول هذه الأنابيب ليس مهما مثل الأنابيب الموجودة على الجانب الآخر من مصيدة الفقاعات.

الوسائط الرائدة إلى خلايا التدفق ، لقد أوضحنا لك الآن كيفية تجميع نظام بنجاح باستخدام مصيدة فقاعة واحدة وخلية تدفق واحدة على نقطة خروج خلية التدفق. لقد قمنا بتوصيل أنابيب طويلة بما يكفي للذهاب إلى تعقيم حاوية النفايات للنظام من أجل تعقيم النظام ، وصنع محلول 0.5 من هيدروكلوريد الصوديوم. ضع أنابيب التغذية للمضخة في محلول الهيدروكلوريد.

في هذه المرحلة ، من المهم للغاية ملء النظام بأكمله بمحلول الهيدروكلوريد. يسمح لمحاقن مصائد الفقاعات بالملء بالكامل بالهيدروكلوريد عند ملئها ، ضع الأغطية مرة أخرى ، والتي في هذه الأثناء كان يجب وضعها في الإيثانول. خطوة مهمة في تعقيم النظام هي إزالة الفقاعات من خلايا التدفق.

يمكن رؤية هذه الفقاعات بسهولة في خلايا التدفق الموضحة هنا ، لكن النجاح الكبير لإزالة الفقاعات يحول المضخة إلى أعلى جولاتها في الدقيقة. سيؤدي ذلك إلى تدفق سائل أعلى في خلايا التدفق ، مما سيساعد في الوقت المناسب على التخلص من الفقاعات ، ورفع خلية التدفق ورفع الأنابيب المؤدية إلى خلية التدفق والنقر بقوة على خلية التدفق على الطاولة لفك الفقاعات من أجل التخلص منها. مع تدفق السائل ، سيستغرق هذا الإجراء أحيانا وقتا طويلا ، لكنك بهذه الطريقة ستتمكن من التخلص من الفقاعات.

إذا كنت مريضا ، فاترك خلايا التدفق معقمة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات بتدفق تقريبي 0.2 ملليمتر في الثانية. غسل النظام أولا في النظام عن طريق السماح للهواء بدفع الهيدروكلوريد خارج النظام بأكمله. نظرا لأن النظام الآن قد تم إفراغه حتى الهيدروكلوريد ، ضع أنبوب التغذية المركزي في زجاجة ماء معقمة وقم بتغطية الجزء العلوي.

النظام الآن إلى الغسل مرتين إلى ثلاث مرات عن طريق ملء فراغ في النظام بالماء المعقم ، وتوصيل الوسط وتشبع الأنابيب بين عشية وضحاها. عند توصيل فقاعة الوسائط بالنظام ، يجب إفراغ النظام من الماء. كما هو الحال مع هيبو كلورات ، املأ سلة المهملات بالوسائط قبل إعادة وضع الأغطية.

عند توصيل الوسائط ، كن حذرا جدا للحفاظ على كل شيء معقما. جهز الإيثانول على الجانب عند نقطة الاتصال. ضع الأنبوبين في الإيثانول قبل توصيل الأنابيب مباشرة.

الآن مع الوسائط المرفقة بالنظام ، أصبحت الآن جاهزة للتشبع أو التلقيح طوال الليل. اعتمادا على اختيار الوسائط التي تتلقيح خلية التدفق. في خلايا التدفق الحيوي DTU ، لديك ثلاثة مواقع تلقيح لغرف النمو الفردية الثلاث.

أول شيء يجب فعله هو تعقيم موقع التلقيح من ثقافة بين عشية وضحاها. اجعلها تلميحا للوصول إلى الكثافة البصرية التي تريدها. استخدم حقنة سعة 500 ميكرولتر بإبرة 27 جم لتلقيح العينة.

يكفي لقاح 250 ميكرولتر لخلايا التدفق الحيوي DTU. الآن يتم مسح موقع التلقيح بتمريرة الإيثانول الصافية ويتم إغلاق جانب التلقيح بغراء السيليكون. الآن اقلب خلية التدفق رأسا على عقب واتركها في هذا الوضع لمدة ساعة دون أي تدفق للوسائط.

بعد أن تكون خلية التدفق مقلوبة لمدة ساعة ، قم بإزالة البطلينوس مرة أخرى وابدأ تدفق الوسائط وضع خلية التدفق في وضع رأسي مرة أخرى. ابدأ الآن في حضانة النظام. يختلف وقت الحضانة واختيار درجة الحرارة بين الخيارات والسلالات والإعدادات التجريبية ، وتلوين غشاء الخميرة الحيوي ، والتصور عن طريق الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر.

من أجل تصور الأغشية الحيوية للخميرة باستخدام مجهر متحد البؤر ، نقوم بلطخها بقعة الحمض النووي الفلوري الأخضر CY تسعة. هنا نستخدم مخففا من واحد إلى ألف. أولا ، يتم إغلاق الأنابيب المؤدية إلى مصائد الفقاعات من خلايا التدفق.

سيمنع ذلك التدفق العكسي من التدفق أثناء إجراء التلوين. الآن أوقف تدفق الوسائط إلى مصيدة الفقاعات. استخدم حقنة سعة 500 ميكرولتر بالنسبة للتلقيح لحقن بقعة cyto nine في غرفة التدفق.

مرة أخرى ، استخدم مناديل الإيثانول لتعقيم موقع التلقيح. حقن 250 ميكرولتر في الغرفة هنا. كن حذرا ولطيفا للغاية.

عند التلقيح يجب أن تكون سرعة التلقيح منخفضة جدا حتى لا تعطل الأغشية الحيوية. أغلق فتحة التلقيح بغراء السيليكون. اترك التلوين يستقر لمدة 15 دقيقة دون تدفق.

انزع المشبك وابدأ التدفق مرة أخرى. أنت الآن جاهز لتحليل الأغشية الحيوية الملطخة. مع الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر ، تحتوي خلايا التدفق على حواف خاصة تتيح وضعها في الحوامل على مرحلة المجهر.

عندما يتم وضع خلية التدفق في مرحلة المجهر ، يتم وضع قطرة من الزيت على زجاج الطبقة. من أجل استخدام هدف الغمر بالزيت ، قم بتشغيل الضوء الأبيض وخفض الهدف حتى يتلامس مع الزيت وتحديد موقع الخلايا في الغرفة. كن حذرا إذا كنت تستخدم كوبا من الطبقة حيث يمكن أن تنكسر بسهولة.

هنا نعرض غشاء حيوي للخميرة كما يظهر مع الضوء الأبيض في المجهر. عندما يتم تشغيل ضوء الفلورسنت ، يمكن للمرء أن يرى بسهولة تلطيخ cyto nine للخلايا. ستمكن صبغة cyto nine الآن من مسح الأغشية الحيوية باستخدام مجهر متحد البؤر.

لمزيد من التحليل باستخدام برنامج Amer ، حدد موقع الاهتمام في غرفة التدفق باستخدام المجهر. تذكر أن تأخذ في الاعتبار البيئات المختلفة التي يتم إنشاؤها بمرور الوقت داخل غرفة التدفق. عند اختيار موقع ، قم الآن بتبديل المجهر من تصور العين إلى التصور بالليزر.

باستخدام برنامج LM بالحجم ، ابدأ الآن في تطبيق إعدادات تحديد العينات ضوئيا. سيعطيك المسح السريع لعيناتك مؤشرا على التركيب الهيكلي للأغشية الحيوية في غرف النمو. قبل البدء في المسح الضوئي عالي الدقة الذي يستغرق وقتا أطول هنا قلنا ما هو الموضع الأول وما هو الموضع الأخير للمسح ، وبالتالي حجم المكدس.

نحن قادرون على مسح الترددات العديدة بسبب أشعة الليزر المختلفة المثبتة في المجهر. سيمكن ذلك من التحقيق في العديد من المجموعات السكانية الفرعية المختلفة. هنا نرى الظل الأخضر تسعة بقع الخميرة الحيوية المعروضة في النافذة من الأطوال الموجية المحددة المستخدمة.

يمكن الآن تحليل كل من مكدسات الفحص في البرامج كأخطاء.