Name: שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: למדו שיטות הצמדה לתיקון קלטות קיבול בטרמינל הפרה-סינפטי Calyx of Held במוח העכבר. הפרוטוקול מדגים הכנת רקמת מוח, שימור בחמצן וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות לחקר שחרור נוירוטרנסמיטרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הצמד תיקון התקנה: אופטיקה: אופטיקה חשובים מאוד למצוא תא טובה, כדי לקבוע את המיקום של זה. נסה להשיג תמונה ברורה של התאים: קצוות חדים, רך למראה תא. סרוק את שדה שלם כדי לחפש טוב התאים העיקריים MNTB עם גביע המצורפת. סיבוב צלחת לחפש calyces מזוויות שונות. בהתחלה זה בסדר להתאמן על מסוף, בלון בצורת. פיק התא על פני השטח של פרוסה או שכבה 2 nd התא. היעד השלישי ראשון 1 / 3 תאים עם פיפטה זיהוי Calyxes: חפש קרום כפול (ראה איור 1), לסובב את המנה פרוסה לראות אותו מזוויות שונות כדי לעזור לאשר כי מדובר גביע. <img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="איור 1" width="298" height="159" /> איור 1 עומק Calyx: Calyx צריך להיות על פני השטח או קרוב לפני השטח ככל האפשר. שטח זמין עבור תיקון: השתמש עדין להתמקד על כפתור מיקרוסקופ כדי לקבוע כיצד &quot;רחב / עמוק&quot; גביע הוא. לדוגמה, ~ 10% סיבוב מלא על המוקד את הקנס ייתן לך יותר שטח מספיק על גבי טלאי. איטום על גבי תא presynaptic: כדי להגיע אל תא מצורף, לחפש עיוות &quot;קטן&quot; על פני התא עקב הלחץ pos (~ 0.15psi) ב פיפטה, להשתמש מניפולטור פיפטה לרוץ למעלה, למטה ולרוחב, ואפילו את פני השטח של הטרמינל presyn לקבל דפורמציה טוב, ואז לשחרר לחץ להחיל יניקה, אם על פי הצורך. PULSE, תוכנית רכישת נתונים: צריך להגדיל את גודל המאגר לפני השימוש הראשון, נדרש בכל פעם על ידי יכולת דגימה. צריך לטעון מאקרו שונה בכל פעם. צומת נוזלי אפשריים: הקלטה פתרון Presyn הוא-11mV (11mV שלילי). Presyn: Cslow = ~ 15 pF Rs comp עבור presyn: 10 μsec, 65% (פיצויים יותר עשוי אפשרי W / החוצה תנודות) לפני קיבול הקלטה: הרפיה הבדיקה הנוכחית (10 mV, 10 msec לקפוץ) כדי לראות אם היא הרפיה monoexponential, כלומר, אם המונח presyn יכול להיות המודל של תא יחיד. מסננים: הגדר בבית kHz 30 ו - 10 kHz (בסל מסנן 1 ו -2 בהתאמה) במהלך המדידה רגיעה, כדי לוודא מרכיב מהיר לא פיספס. במהלך ההקלטות מיני, המשמש Xinsheng 10 קילוהרץ ו 5kHz. LGW שאל אותי להשתמש רק להגדיר מסנן 1 ב 30 קילוהרץ כדי לוודא שאנחנו יכולים למדוד עליית פעמי של מיני. שמות קבצים: 7 ספרות 000mmxx, כאשר mm הוא החודש (או חודש, שנה) ו xx הוא מספר התא. ניקוי קווי הפתרון: קווים לנקות בסוף הניסוי עם 20 מ&quot;ל של HCl 0.1 M ואחריו 200 מ&quot;ל ddH2O. פתרונות חיצוניים הם ממוחזרים, מהירות המשאבה הוא 20-30 סל&quot;ד. (פתרון החוזרים קאמרית אמבטיה זורם חזרה לתוך צילינדר המדורג). הגדרת 3 קווי היוצא על מנת להבטיח יניקה מספיק. פיפטה פתרון הקלטה Presynaptic: ~ 310 מילי Osmolar הפתרון צריך להיות Presyn ~ 310 mOsm למנוע R-גישה להגדיל במהלך הניסוי. פתרון Presyn פיפטה שונה postsyn פיפטה פתרון (Presyn יש ATP GTP &amp; עבור לשעבר.). TTX-TEA פתרון (לבודד Ca זרמים): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נסו ליישם לאחר איטום, או אפילו תיקון, על התא, כמו תה בלוקים הפתרון K-ערוצים depolarizes התא. זה לא טוב עבור התא. מאותה סיבה, זה לא יהיה ניתן לעשות שימוש חוזר פרוסה אחרי TTX מוחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את התגובה הראשונה והאחרונה של התא, או פרוסה כדי לבדוק השפעה כלשהי של שלילת קוטביות ממושכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TTX משמש ב 1 מיקרומטר במקום 0.5 מיקרומטר ולכן ההשפעה היא מהירה יותר. צריך לחכות פחות זמן לאחר שינוי פתרונות. </li></ul> חיתוך Slices Vibratome הגדרות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70Hz רעידות לרוחב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Amplitude: 1.0 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קדימה במהירות 0.01-0.02 מ&quot;מ / sec בזמן חיתוך פרוסות עם גביע, 0.1 אחרת עובי: 180 מיקרומטר (~ 150מיקרומטר בבעלי חיים מבוגרים) </li></ul> Slices לדגור על 37 º C למשך שעה 1 (כולל זמן חיתוך), כלומר, להשאיר באמבטיה 15-20 דקות לאחר חיתוך. Pipettes: Presyn: 3.5-4.5 MΩ בהתחלה, 3.0-3.5 MΩ כאשר מרגישים בטוחים יותר שימוש ידני חולץ להגדיר הגדרות. השתמש בתכונה עיכוב בגלל זכוכית עבה (עיכובים בעבודה 200 או 1) זכוכית סוג: בורוסיליקט, תקן הקיר, אין נימה קוטר חיצוני: 2.0 מ&quot;מ קוטר פנימי 1.16 מ&quot;מ אורך: 7.5 ס&quot;מ

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן calyx

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

אנו מדגימים את הטכניקות הבסיסיות הקלטה תיקון presynaptic מהדק את גביע של הלד, מסוף יונקים העצבים המרכזית מערכת העצבים. הקלטות חשמל ממסוף presynaptic לאפשר מדידה של פוטנציאל פעולה, ערוץ זרמי סידן, איחוי שלפוחית ​​(exocytosis) ספיגת הקרום הבאים (אנדוציטוזה). שילוב של שלפוחית ​​המכילה הנוירוטרנסמיטר גורם קרום שלפוחית ​​שיתווספו קרום התא של גביע. גידול זה בהיקף של קרום התא הוא, כפי שהיא נמדדת עלייה קיבול. הירידה עוקבת קיבול מציין אנדוציטוזה, תהליך של ספיגת קרום או הסרה של קרום גביע. אנדוציטוזה, נחוצה כדי לשמור על המבנה של גביע והוא נחוץ גם כדי ליצור שלפוחית ​​כי יתמלאו הנוירוטרנסמיטר לאירועים exocytosis בעתיד. הקלטות קיבול על גביע של הלד אפשרו ישירות ובמהירות למדוד לשחרר שלפוחי ו אנדוציטוזה מאוחרות מסוף יונקים עצב במערכת העצבים המרכזית. בנוסף, הפעילות postsynaptic המקביל ניתן למדוד בו זמנית באמצעות הקלטות לזווג. לכן תמונה מלאה של הפעילות החשמלית presynaptic ו postsynaptic בסינפסה מערכת העצבים המרכזית הוא בר השגה באמצעות הכנה. כאן, שיטות להכנת פרוסה, תכונות מורפולוגיות לזיהוי calyces, בטכניקות נערך תיקון בסיסי clamping, ודוגמאות של הקלטות קיבול למדוד exocytosis ו אנדוציטוזה מוצגים.

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

אנו מדגימים את הטכניקות הבסיסיות להקלטת patch clamp פרה-סינפטית ב-calyx of Held, קצה עצבי של מערכת העצבים המרכזית ביונקים. ...

שלום, שמי קן פראדיסו. אני עובד עבור לינג גנג וו בתוכנית הפנימית של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, הממוקם בקמפוס בתסדה של ה-NIH. אני אציג בפניכם את הטכניקות להקלטה פרה-סינפטית של ה-calyx held באמצעות Patch clamping.כדי להכין את רקמת המוח, אנו מוציאים את המוח מהחולדה. אנו מניחים את המוח בתוך תמיסה זו, שהיא תמיסה קרה מאוד (בטמפרטורת קרח) עם ריכוז סידן נמוך, המבעבעת בקרבוגן (carbogen) כדי להבטיח אספקת חמצן רציפה למוח. כמו כן, התמיסה חייבת להיות קרה מאוד כדי למזער את מידת הנזק.כעת המוח נמצא בתמיסה זו. נוציא אותו ונחתוך אותו באופן מתאים כך שניתן יהיה להניח אותו על התושבת, ונקבע אותו לתושבת באמצעות Sano correlate או דבק מהיר. לאחר מכן, נמלא את התא בתמיסת סידן נמוך קרה מאוד, נהסמיח אותה (bubble), נניח אותה על הוibratome ונחתוך פרוסות בעובי של 180 עד 190 microns, בתדירות להב של 70 hertz ובמהירות התקדמות קדימה של 0.01 עד 0.02 millimeters per second. כלומר, 10 עד 20 microns per second.לאחר ביצוע כל חיתוך, אנו מעבירים את הפרוסות מהסליין הקר על קרח לתא זה, המכיל תמיסת סידן רגילה. זוהי אותה תמיסה שבה אנו מבצעים את ההקלטה, והיא נמצאת בטמפרטורה פיזיולוגית של 37 °C. לאחר מכן, אנו מניחים את הפרוסות כאן לצורך התאוששות.הוא נשאר כאן למשך חצי שעה עד שעה לפני ביצוע ניסויי הפיזיולוגיה. כעת, יש לי

methods-for-patch-clamp-capacitance-recordings-from-the-calyx

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה נועד כהקדמה תיקון הקלטה מהדק מ ביציות Xenopus laevis. היא משתרעת על הסרת vitelline קרום, היווצרות חותם gigaohm (gigaseal), ואת ההמרה אופציונלי של תיקון כדי טופולוגיה מחוץ הקצוב.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי...

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הקלטת כל תא תיקון מהדק של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים היקפי mononuclear תאים שמקורם בדם אנושי לימפוציטים-T.

Whole Cell-הקלטה של ​​סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

לאחר אקסוציטוזיס, קרום הפלזמה המאוחה מאוחזר בתהליך המכונה אנדוציטוזיס. מנגנון זה מתקן שלפוחיות סינפטיות חדשות לסבב השחרור הבא. אירועים אנדוציטיים בודדים נלכדים ומנותחים באמצעות הקלטות הקיבול המחוברות לתאים בתאי כרומפין יותרת הכליה של העכבר.

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה יעילה לרכישה דינמית בזמן אמת של זרמי תעלה אשלגן מגודר מתח (Kv) בקרדיומיוציטים H9c2 באמצעות טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים.

רישום זרם אשלגן תלוי מתח על קרדיומיוציטים H9C2 באמצעות טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים

זהו מדריך כדי לשנות את הצורה של micropipettes זכוכית. באופן ספציפי, באמצעות חום ולחץ אוויר להתחדד הוא התרחב מבלי להגדיל את פתיחת קצה, המוביל פיפטה התנגדות נמוכה יותר. זה קריטי כדי להשיג הקלטות רעש נמוך של תאים קטנים אך שימושית ביישומים רבים.

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

למדו שיטות הצמדה לתיקון קלטות קיבול בטרמינל הפרה-סינפטי Calyx of Held במוח העכבר. הפרוטוקול מדגים הכנת רקמת מוח, שימור בחמצן וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות לחקר שחרור נוירוטרנסמיטרים.

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

גלה סרטונים נוספים