Name: NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez la quantification des acides nucléiques par microvolume avec les spectrophotomètres NanoDrop 2000 C et 3300. Ces méthodes directes et par fluorescence offrent précision, sensibilité et rapidité avec seulement un microlitre d'échantillon.

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Richard W. Beringer et David L. Ash, scientifiques applications, produits Thermo Scientific NanoDrop, d&#39;assistance technique et de tournage.

1. Quantification microvolume acide nucléique en utilisant une NanoDrop 2000c Spectrophotomètre <ol><li> Pour commencer, nettoyer les surfaces supérieures et inférieures optique du système de rétention spectrophotomètre microvolume échantillon par pipetage 2 à 3 uL d'eau déminéralisée propre sur la surface inférieure optique. </li><li> Fermer le bras de levier, assurant que le piédestal supérieure vient en contact avec l'eau déminéralisée. Soulever le bras de levier et essuyez les surfaces optiques avec un chiffon propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. </li><li> Ouvrez le logiciel NanoDrop et sélectionnez l'application des acides nucléiques. Utiliser un petit volume, pipette calibrée pour effectuer un essai à blanc en supprimant 1 ul de tampon sur la surface inférieure optique. Abaissez le bras de levier et sélectionnez "vierge" dans l'application des acides nucléiques. </li><li> Une fois l'essai à blanc est terminée, nettoyer les deux surfaces optiques avec un chiffon propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. </li><li> Choisissez la constante appropriée de l'échantillon qui doit être mesuré. <table border="1"><tbody><tr><td> Type d'échantillon </td><td> Sélectionnez l'option </td><td> Constante utilisée pour calculer la concentration </td></tr><tr><td> ADNdb </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ADNss </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ARN </td><td> ARN-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Personnalisé </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Typiques nucléiques gammes de concentration d'acide pour les mesures d'absorbance A280 directe en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop microvolume, une cuvette traditionnelle basée spectrophotomètre utilisé avec une cuvette TrayCell Microcell, et un fluorospectrometer NanoDrop microvolume en conjonction avec le dosage PicoGreen. </li><li> Répartir 1 ul d'échantillon d'acides nucléiques sur la partie inférieure piédestal optique et fermer le bras de levier. Parce que la mesure est indépendant du volume, l'échantillon a seulement besoin de combler le fossé entre les deux surfaces optiques pour une mesure à prendre. </li><li> Sélectionnez "mesure" dans le logiciel d'application. Le logiciel calcule automatiquement le taux de concentration d'acides nucléiques et de pureté. Suite à la mesure de l'échantillon, l'examen de la sortie spectrale. </li><li> Le logiciel calcule automatiquement le taux de concentration d'acides nucléiques et de pureté. Suite à la mesure de l'échantillon, l'examen de l'image spectrale pour évaluer la qualité de l'échantillon. </li><li> Un échantillon d'acide nucléique typiques ont un profil très caractéristique. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Un échantillon d'acide nucléique typiques ont un profil très caractéristique. </li><li> Les sources communes de polluants associés à des techniques d'isolement nucléiques acides comprennent l'extraction phénol / Trizol et la colonne. Dans le cas de l'extraction phénol / Trizol, la contamination réactif résiduel peut être indiquée par des spectres anormaux entre 220 à 240 nm ainsi que par des changements dans la région 260-280 nm. Inversement, la guanidine résiduelles provenant de l'extraction de colonne peut contribuer à un pic de près de 230 nm et un changement dans le creux de 230 nm à environ 240 nm. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Les changements dans les pics et les creux des échantillons B et C par rapport à l'échantillon A d'illustrer comment les contaminants peuvent affecter les spectres des échantillons d'acide nucléique. </li><li> Pour évaluer avec précision la qualité des échantillons, 260/280 ou 260/230 ratios doivent être analysés en combinaison avec la qualité spectrale globale. Pur acides nucléiques généralement un ratio de rendement des 260/280 ~ 1,8 et un ratio de 260/280 de ~ 2.0 pour l'ADN et l'ARN, respectivement. Ce ratio est dépendant du pH et la force ionique du tampon utilisé pour faire l'ébauche et les mesures d'échantillons. Des solutions acides seront sous-représenter le ratio de 0,2-0,3, tandis qu'une solution de base sera sur-représenter le ratio de 0,2-0,3. Ratios significativement différents de pureté peut indiquer la présence de protéines, de contaminants de phénol ou d'autres qui absorbent fortement à ou près 280 nm. Le ratio 260/230 pureté est une deuxième mesure de pureté de l'ADN avec des valeurs pour un acide nucléique «pure» couramment de l'ordre de 1.8 à 2.2. Ratios de pureté qui sont nettement inférieurs aux valeurs attendues peuvent indiquer la technique d'isolement utilisées peuvent nécessiter une optimisation plus poussée. </li><li> Spectrophotomètres NanoDrop peut également être utilisé pour quantifier les protéines à l'aide d'absorbance directe ou par des analyses de protéines colorimétrique. Pour assurer la formation adéquate et une reproductibilité de colonne, 2-ul échantillons sont conseillés pour les échantillons de protéines. Se référer à la vidéo suivante JoVE: Détermination microvolume concentration de protéines utilisant le spectrophotomètre NanoDrop <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Pour démontrer à haute sensibilité quantification microvolume acide nucléique en utilisant les 3300 NanoDrop, un kit PicoGreen fluorescence est utilisée. Pour commencer, à équilibrer le kit normes et tous les échantillons d'acides nucléiques à température ambiante. Échantillons fluorescents sont sensibles à la lumière et doit être conservé dans l'ambre ou des tubes enveloppés aluminium. </li><li> Préparez assez 1x tampon TE pour toutes les normes et les échantillons à mesurer, ainsi que pour la solution PicoGreen travail qui sera nécessaire. Préparer un tampon 1xTE en diluant le tampon TE 20x fourni avec une eau sans nucléase par le protocole du fabricant. Volumes de réaction peut varier de 200 uL d'aussi peu que 10 ul. Dans cet exemple, 10 volumes de réaction uL sera préparé. </li><li> Préparer dilués en série de normes ADNdb à 2x la concentration finale souhaitée sans nucléase flacons ou des tubes. Transférer 5 ul de chacune des normes ADNdb dilué dans un individu étiqueté sans nucléase ambre ou de papier d'aluminium couverte tube. </li><li> Aliquote de 5 ul de chaque échantillon ADNdb d'intérêt dans dûment étiquetés sans nucléase ambre ou de papier d'aluminium recouvert tubes. </li><li> Préparer la solution PicoGreen de travail selon le protocole du fabricant. Transfert d'un volume égal de la solution PicoGreen de travail dans chaque tube contenant soit une norme ou un échantillon d'intérêt (5 uL dans cet exemple). </li><li> Combiner des volumes égaux de 1x tampon TE et PicoGreen solution de travail pour préparer le contrôle négatif, qui sert de solution de référence. </li><li> Mélanger le contenu de chaque tube de réaction à fond par pipetage doux et incuber les réactions à la température ambiante pendant 5 minutes. Toutes les normes et les échantillons doivent être équilibrées à la même température avant la mesure en tant que signal de fluorescence est affectée par la température. </li><li> Pour préparer l'instrument et effectuer des mesures, d'abord nettoyer les surfaces inférieure et supérieure du système de rétention de l'échantillon. Pipeter 2 à 3 uL d'eau déminéralisée sur la surface inférieure d'optique, à proximité, puis ouvrez le bras de levier, et éponger les piédestaux supérieure et inférieure avec un chiffon propre, non pelucheux, essuyez laboratoire. Assurez-vous que les surfaces sont libres de charpie avant de procéder comme charpie peuvent présenter fluorescence en présence d'une source d'excitation et peut interférer avec la mesure. </li><li> Ouvrez le logiciel de l'instrument, sélectionnez l'option "Nucleic Acids" application, et sélectionnez l'option "PicoGreen-ADNdb" option. </li><li> Pour l'instrument vierge, ajouter 2 ul de TE 1x à la baisse piédestal, fermer le bras, et sélectionnez "vierge" dans le domaine logiciel de l'instrument. Une fois vide est complet, éponger hors de la solution à blanc par les deux surfaces du système de rétention de l'échantillon. </li><li> Mélanger la solution de référence par pipetage doux. En utilisant des pointes faible rétention, pipette 2 uL sur la partie inférieure piédestal et fermer le bras. </li><li> Sélectionnez "référence" dans le type de mesure, et de sélectionner les unités désirées. Cliquez sur "Mesure" pour lancer le cycle de mesure. </li><li> Lorsque le cycle de mesure est terminée, ouvrez le bras et à fond blot sur les surfaces de l'échantillon de rétention du système. Mesure jusqu'à cinq répétitions de la référence, en utilisant une aliquote fraîche pour chaque réplique. </li><li> Répétez le processus pour les normes supplémentaires pour construire une courbe standard. Jusqu'à sept normes peuvent être utilisés. Le logiciel est conçu pour stocker jusqu'à cinq répétitions pour chaque norme. Réplique des normes sont en moyenne de générer une courbe standard à partir de laquelle les concentrations de l'échantillon sont déterminés automatiquement. </li><li> Une fois la courbe standard est complète, sélectionnez l'option "échantillons" onglet, entrez les informations de l'échantillon respectifs ID et de mesurer chaque échantillon inconnu. </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

Philippe Desjardins et Debra Conklin sont employés par des produits Thermo Scientific NanoDrop, Inc qui produit des instruments utilisés dans cet article.

Les protocoles de quantification présentées ici sont basées sur les systèmes les plus largement acceptées microvolume. Ces systèmes fournissent des solutions de rechange pratique pour méthode traditionnelle d'acide nucléiques quantification, qui reposent sur des volumes d'échantillon plus grande et l'utilisation d'appareils de confinement. NanoDrop microvolume technologie utilise un système de rétention d'échantillon qui s'appuie sur les propriétés de tension superficielle de l'échantillon mesuré pour former une colonne liquide. Il est essentiel que l'échantillon est en contact avec les surfaces supérieures et inférieures de mesure optique pour la formation de la colonne appropriée. Si à tout moment les résultats de mesure semblent inexactes ou non reproductibles, il est probablement le résultat de l'hétérogénéité de l'échantillon ou le bris de colonne liquide. Détergents et d'alcool isopropylique ne sont pas recommandés agents de nettoyage, car ils peuvent incondition les surfaces de mesure piédestal. Un piédestal inconditionnée se produit lorsque les propriétés de surface hydrophobe du piédestal a été compromise, ce qui entraîne un aplatissement de la goutte d'échantillon. Socles Inconditionné peut conduire à la rupture de la colonne de liquide pendant le mesurage. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Surface de la figure 3. Inconditionné est caractérisée par un aplatissement d'une goutte d'eau. Surfaces piédestal Uncondtioned peut être reconditionné en utilisant le composé piédestal NanoDrop reconditionnement (PR-1, Thermo Scientific Products NanoDrop). Une fine couche de composé reconditionnement est appliqué sur les surfaces supérieures et inférieures piédestal, on laisse sécher pendant environ 30 secondes, puis déteint l'aide d'un endroit propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. Un état avec succès reconditionnés est caractérisée par une gouttelette d'eau perlant place lorsqu'il est appliqué à la surface piédestal bas. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Une surface reconditionnés est caractérisée par un perlage d'une goutte d'eau. Systèmes de quantification microvolume réduire considérablement la consommation de l'échantillon et augmenter considérablement la gamme de concentration par rapport aux systèmes quantification plus traditionnels. Bien que la quantification microvolume est souvent devenu une technologie habilitante pour des circonstances impliquant la masse cellulaire limitée tels que biopsies à l'aiguille et le laser capture microdissection, l'efficacité et la facilité d'utilisation de cette méthodologie a fait largement accepté alternative aux méthodes de quantification d'acides nucléiques, même lorsque l'échantillon est abondante.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantification des acides nucléiques

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Dosages biomoléculaire sont continuellement développés qui utilisent des quantités progressivement plus petites de matériel, souvent obstacle à l&#39;utilisation de la cuvette conventionnelle basée sur des instruments de quantification d&#39;acides nucléiques pour ceux qui peuvent effectuer une quantification microvolume. Le système de rétention NanoDrop microvolume échantillon (Produits Thermo Scientific NanoDrop) en combinant les fonctions technologie des fibres optiques et les propriétés naturelles tension de surface pour capturer et retenir des quantités infimes d&#39;échantillon indépendant de l&#39;appareil de confinement traditionnels tels que les cuvettes ou capillaires. Par ailleurs, le système utilise la longueur des trajets plus courts, ce qui résulte dans une large gamme de mesures de concentration d&#39;acide nucléiques, éliminant la nécessité d&#39;effectuer des dilutions. Réduire le volume d&#39;échantillon requis pour l&#39;analyse spectroscopique facilite également l&#39;inclusion d&#39;autres étapes de contrôle qualité tout au long de nombreux flux moléculaire, augmentant l&#39;efficacité et conduisant finalement à une plus grande confiance dans les résultats en aval. La nécessité d&#39;une haute sensibilité d&#39;analyse de fluorescence de masse limitée est également apparu avec les récentes avancées expérimentales. Utilisant la même technologie microvolume de rétention de l&#39;échantillon, les mesures de fluorescence peut être réalisée avec 2 pi de matériel, permettant des dosages fluorescents exigences de volume pour être sensiblement réduits. Ces microréactions de 10 uL ou moins sont désormais possibles en utilisant une fluorospectrometer dédié microvolume. Deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acide sera démontré que l&#39;utilisation de systèmes intégrés de conservation de l&#39;échantillon comme des alternatives aux pratiques traditionnelles cuvette des protocoles. D&#39;abord, une méthode directe A260 d&#39;absorbance avec un spectrophotomètre microvolume est décrite. Elle est suivie par une démonstration d&#39;une méthode de fluorescence qui permet aux volumes réduits réactions de fluorescence avec un fluorospectrometer microvolume. Ces nouvelles techniques permettent l&#39;évaluation des concentrations d&#39;acides nucléiques allant de 1 pg / uL à 15.000 ng / uL avec une consommation minimale de l&#39;échantillon.

L&#39;utilisation de systèmes microvolume NanoDrop comme des alternatives concrètes et efficaces pour méthode traditionnelle d&#39;acide nucléiques quantification est décrite à travers la démonstration de deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acides.

NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Des essais biomoléculaires sont continuellement développés et utilisent des quantités de matériel progressivement plus faibles, ce qui exclut souvent l'utilisation de méthodes conventionnelles...

Le système de rétention d'échantillons NanoDrop est une technologie innovante qui utilise la tension superficielle intrinsèque des liquides pour maintenir et mesurer des échantillons de volume microscopique entre deux supports optiques, sans recourir à des QTS ni à des capillaires. Aussi peu qu'un microlitre d'échantillon est pipeté directement sur la surface optique inférieure. Lors de la fermeture du bras du spectromètre, une colonne de liquide se forme entre les supports optiques supérieur et inférieur.Grâce à la tension superficielle formant un trajet optique vertical, la longueur du trajet peut automatiquement changer en temps réel pendant la mesure. Le raccourcissement du trajet permet la mesure de concentrations plus élevées, éliminant ainsi efficacement la nécessité de réaliser des dilutions pour la plupart des échantillons d'acides nucléiques. De plus, le système de rétention de l'échantillon accélère le processus expérimental grâce à un nettoyage rapide, qui consiste simplement à essuyer les surfaces optiques avec un chiffon de laboratoire.Aujourd'hui, nous allons démontrer deux procédures permettant de déterminer la concentration en acides nucléiques à l'aide d'un instrument thermoscientifique à volume micro. Le premier protocole consiste en une mesure directe des acides nucléiques à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop 2000 C. Le second protocole est une mesure indirecte par fluorescence des acides nucléiques à l'aide du fluorospectromètre NanoDrop 3,300.Pour commencer, nettoyez les surfaces optiques supérieure et inférieure du système de rétention d'échantillon du spectrophotomètre à volume micro en pipetant deux à trois microlitres d'eau déionisée propre sur la surface optique inférieure. Abaissez le bras articulé afin que le plot supérieur entre en contact avec l'eau déionisée. Relevez le bras articulé et essuyez soigneusement les deux surfaces optiques à l’aide d’un chiffon de laboratoire propre, sec et sans particules.Ensuite, ouvrez le logiciel NanoDrop et sélectionnez l'application acide nucléique. Utilisez une pipette calibrée de petit volume pour effectuer une mesure de blanc en déposant un microlitre de tampon sur la surface optique inférieure. Abaissez le bras articulé et sélectionnez « blanc » dans l'application acide nucléique.Une fois la mesure du blanc terminée, nettoyez les deux surfaces optiques avec un essuie-laboratoire. Comme précédemment, sélectionnez la constante appropriée pour l'échantillon à mesurer. Ensuite, déposez un microlitre d'échantillon d'acide nucléique sur le socle optique inférieur et abaissez le bras de levier.Étant donné que la mesure est indépendante du volume, l'échantillon doit simplement former un pont entre les deux surfaces optiques. Pour effectuer une mesure, sélectionnez « mesurer » dans le logiciel de l'application ; le logiciel calculera automatiquement la concentration en acides nucléiques et les rapports de pureté. Après la mesure de l'échantillon, examinez le spectre obtenu. Un échantillon typique d'acide nucléique présente un profil très caractéristique.Les indicateurs spectraux d'un échantillon de mauvaise qualité incluent des pics à la baisse et au niveau du pic à 260 nanomètres. Les sources courantes de contaminants associées à des techniques spécifiques d'isolement des acides nucléiques comprennent le phénol, le triol et l'extraction sur colonne. Dans le cas de l'extraction au phénol-triol, une contamination résiduelle par les réactifs peut se manifester par des spectres anormaux entre 220 et 240 nanomètres, ainsi que par des décalages dans la région allant de 260 à 280 nanomètres.En revanche, les résidus de guanine provenant de l'extraction par colonne peuvent contribuer à un pic proche de 230 nanomètres et à un décalage du creux de 230 nanomètres vers environ 240 nanomètres. Pour évaluer précisément la pureté de l'échantillon, le rapport 260/280 et le rapport 260/230 doivent être analysés conjointement avec la qualité spectrale globale. Les acides nucléiques purs donnent généralement un rapport 260/280 d'environ 1,8 pour l'ADN et d'environ 2,0 pour l'ARN.Ce rapport dépend du pH et de la force ionique du tampon utilisé pour effectuer les mesures du blanc et de l'échantillon. Le spectrophotofluorimètre Banana drop 3, 300 utilise le même système breveté de rétention d'échantillon en microvolume que le spectrophotomètre NanoDrop 2000 C. Les mesures de fluorescence étant réalisées avec aussi peu qu'un microlitre d'échantillon, l'utilisateur choisit l'une des trois DEL comme source d'excitation, qui émet horizontalement vers l'échantillon.La fluorescence de l'échantillon ultérieure est ensuite collectée à un angle de 90 degrés verticalement dans un spectromètre interne. Pour démontrer la quantification de nucléotides en microvolume avec une haute sensibilité à l'aide du NanoDrop 3300, un kit de fluorescence Pico Green est utilisé pour commencer à équilibrer les étalons du kit ainsi que tous les échantillons d'acides nucléiques à température ambiante. Les échantillons fluorescents sont sensibles à la lumière et doivent être conservés dans des tubes en verre ambré ou enveloppés d'aluminium.Préparez suffisamment de tampon 1X TE pour toutes les normes et échantillons à mesurer, ainsi que pour la solution de travail au pico vert nécessaire. Préparez le tampon 1X TE en diluant le tampon 20X TE fourni avec de l'eau sans noyau selon le protocole du fabricant. Les volumes de réaction peuvent varier de 200 microlitres à seulement 10 microlitres.Dans cet exemple, nous préparerons des volumes de réaction de 10 microlitres. Ensuite, préparez des étalons d'ADN double brin dilués en série ainsi que des vials ou des tubes sans nuclease. Cela couvrira la plage de concentration attendue des échantillons d'ADN inconnus.Transférez cinq microlitres de chacun des étalons d'ADN double brin dilués dans un tube individuellement étiqueté, sans nucléase et protégé de la lumière (tube ambré ou recouvert de papier d'aluminium). Ensuite, aliquotez cinq microlitres de chaque échantillon d'ADN double brin d'intérêt dans le tube correspondant protégé de la lumière. Après avoir préparé la solution de travail Pico Green selon le protocole du fabricant, ajoutez un volume équivalent de cette solution à chaque tube contenant soit un étalon d'ADN double brin, soit un échantillon d'ADN double brin, soit dans ce cas cinq microlitres.Combinez des volumes égaux d'un tampon XTE et de la solution de travail Pico Green. Pour préparer le témoin négatif qui sert de solution de référence, mélangez soigneusement le contenu de chaque tube par pipetage doux et laissez incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Toutes les normes et échantillons doivent être équilibrés à la même température avant la mesure, car le signal fluorescent est influencé par la température. Pour préparer l'appareil et effectuer les mesures, nettoyez d'abord les surfaces inférieure et supérieure du système de rétention de l'échantillon, puis pipetez deux à trois microlitres d'eau déionisée sur la surface optique inférieure. Ensuite, ouvrez le bras de levier et essuyez les plateaux supérieur et inférieur avec un chiffon de laboratoire propre et sans peluches.Veillez à ce que les surfaces soient exemptes de peluches avant de poursuivre. En effet, les peluches peuvent présenter une fluorescence en présence d'une source d'excitation et peuvent interférer avec la mesure. Ouvrez le logiciel de l'appareil.Sélectionnez l'application acides nucléiques et choisissez l'option ADN double brin pico vert. Pipetez deux microlitres de XTE 1X sur le socle inférieur. Fermez le bras de levier et sélectionnez « blanc » dans le champ logiciel de l'instrument. Une fois le blanc terminé, essuyez la solution de blanc sur les deux faces du système de rétention d'échantillon.Ensuite, mélangez la solution de référence en pipetant doucement à l’aide de pointes à faible rétention. Pipetez deux microlitres de la solution de référence sur le socle inférieur et fermez le bras de levier. Sélectionnez « référence » sous l’onglet étalons et choisissez les unités souhaitées.Cliquez sur mesurer pour lancer le cycle de mesure. Une fois le cycle de mesure terminé, ouvrez le bras de levier et essuyez soigneusement les surfaces du système de rétention de l'échantillon. Effectuez jusqu'à cinq réplicats du témoin en utilisant un Eloqua neuf pour chaque réplicat.Répétez le processus pour les étalons supplémentaires afin d'élaborer une courbe d'étalonnage. Jusqu'à sept étalons peuvent être utilisés. Le logiciel est conçu pour stocker jusqu'à cinq réplicats pour chaque étalon.Les réplicats des étalons sont moyennés pour générer une courbe standard à partir de laquelle les concentrations des échantillons sont déterminées automatiquement. Une fois la courbe standard terminée, sélectionnez l'onglet échantillons, saisissez les informations d'identification des échantillons respectifs et mesurez chaque échantillon inconnu. Une courbe valide indique que le nombre minimal d'étalons requis a été atteint.La concentration d'ADN est automatiquement déterminée à partir de la courbe standard. Les instruments à microvolume NanoDrop peuvent déterminer la concentration en acides nucléiques soit par des mesures directes d'absorbance à 260 nm, soit par des méthodes fluorométriques indirectes. Les spectrophotomètres NanoDrop peuvent également être utilisés pour quantifier les protéines en mesurant l'absorbance directe à 280 nm ou par des dosages colorimétriques des protéines.

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